أو-تفاعل Slp1 البوليمرات واحد رقائق من Lysinibacillus كروي JG-B53 - QCM-D، ICP-MS وAFM كأدوات للدراسات جزيء حيوي المعادن

الهدف العام من هذه التجربة هو التحقيق في سلوك امتصاص الذهب بواسطة بروتينات الطبقة S من السلالة البكتيرية المعروضة من وجهة نظر بيئية وتكنولوجية. يمكن لهذه الأساليب الإجابة على السؤال الرئيسي في العلوم المتعلقة بالبيئة في مجالات عمليات الامتصاص وإزالة المعادن واستعادتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنه يمكنك اكتشاف امتصاص المعادن وامتصاص الجسيمات النانوية في نطاق مقياس آخر.

باستخدام QCM-D ، من الممكن اكتشاف ذلك في قياس في الوقت الفعلي. لبدء هذا الإجراء ، قم بتجهيز خلايا السوائل بدمى المستشعر. ضخ ما لا يقل عن 20 مل لكل وحدة من عامل تطهير السائل القلوي بنسبة 2٪ في المياه فائقة النقاء من خلال نظام QCM-D والأنبوب.

بعد ذلك ، قم بضخ حجم خمسة أضعاف لكل وحدة من الماء عالي النقاء عبر النظام بمعدل تدفق يصل إلى 300 ميكرولتر في الدقيقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بتنظيف مستشعرات ثاني أكسيد السيليكون خارج وحدات التدفق عن طريق الحضانة في محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 2٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. ثم اشطف المستشعرات عدة مرات بالماء فائق النقاء.

بعد تجفيف البلورات بالهواء المضغوط المصفى ، ضعها في غرفة تنظيف الأوزون لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، كرر إجراء التنظيف مرتين لإزالة جميع المحتويات العضوية. لإزالة المعادن المرتبطة من سطح المستشعر ، اشطف المستشعرات بحمض النيتريك المولي الواحد.

ثم اشطف المستشعرات عدة مرات بالماء عالي النقاء. بعد ذلك ، قم بتعديل المستشعرات بثلاثة جرامات لكل لتر من الطبقات المتناوبة من البولي إيثيلينيمين وسلفونات البوليسترين عبر طلاء الغمس باستخدام تقنية الطبقة تلو الأخرى أو LBL. ضع المستشعرات داخل محلول البولي إلكتروليت المناسب في ألواح عميقة الآبار واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المستشعرات من محلول البولي إلكتروليت واشطفها بين كل خطوة طلاء غمس بشكل مكثف بالماء عالي النقاء. بمجرد اكتمال التعديل الخارجي ، ضع المستشعرات داخل وحدة التدفق. قم بموازنة المستشعرات عن طريق شطفها بالماء فائق النقاء قبل بدء التجارب.

في هذه المرحلة ، قم بإذابة Slp1 المعزولة والمطهرة مسبقا في تركيبة اليوريا لتحويل البوليمرات إلى مونومرات. الطرد المركزي البروتينات الأحادية عند 15 ، 000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة لإزالة تكتلات البروتين الأكبر. امزج المادة المطفية Slp1 القابلة للذوبان والطرد المركزي مع المخزن المؤقت لإعادة التبلور إلى تركيز بروتين نهائي يبلغ 0.2 جرام لكل لتر.

بعد إعادة بلورة البروتين الناجحة أعلى المستشعرات المعدلة بالكهرباء داخل وحدات التدفق ، اشطف المستشعرات المطلية بمخزن مؤقت لإعادة التبلور بشكل مكثف بمعدل تدفق يبلغ 125 ميكرولتر في الدقيقة حتى يتم الكشف عن قيم مستقرة لتحولات التردد والتبديد. بعد طلاء Slp1 الناجح في وحدات التدفق ، اشطف طبقة Slp1 التي تم الحصول عليها بشكل مكثف باستخدام 1.6 مللي مولار من السترات الدرجة الحموضة 5.0 حتى يتم الكشف عن قيم مستقرة لتحولات التردد والتبديد. بعد ذلك ، قم بضخ محلول جسيمات نانوية مليمولاري معد مسبقا إلى وحدات التدفق بمعدل تدفق يبلغ 125 ميكرولتر في الدقيقة.

ثم تتبع الامتزاز الكتلي إلى طبقة Slp1. بعد الانتهاء من تفاعل الجسيمات النانوية المعدنية ، اشطف الطبقة بمخزن مؤقت خال من الجسيمات النانوية لإزالة المعادن أو الجسيمات النانوية الضعيفة. باستخدام مجهر القوة الذرية أو AFM باستخدام مجهر بصري مقلوب ، قم بتسجيل الصور في السائل باستخدام الماء عالي النقاء مباشرة على مستشعرات QCM-D المطلية.

اشطف المستشعرات بالماء فائق النقاء بعد تجارب QCM-D وضعها داخل خلية سائل AFM. استخدم ناتئا بتردد رنين يبلغ حوالي 25 كيلو هرتز في الماء وصلابة أقل من 0.1 نيوتن لكل متر. اضبط سرعة المسح بين 2.5 و 10 ميكرومتر في الثانية.

التقط صورا في وضع التلامس الديناميكي بينما يكون الكابول متحمسا بواسطة بيزو بتردد الرنين. أخيرا ، حدد مسافة الكابول إلى السطح عن طريق التخميد المتذبذب. تظهر قدرات الربط المعدنية القصوى للذهب ثلاثة بواسطة Slp1 المعلق أنه كان مرتبطا بثبات خلال فترة الحضانة لمدة 24 ساعة ضمن نطاق الأس الهيدروجيني الذي تم فحصه.

يشير الانخفاض الفوري في التردد إلى امتصاص سريع وتقارب كبير للبروتينات مع السطح المعدل متعدد الإلكتروليتات. يزداد التبديد أيضا على الفور مما يشير إلى امتصاص جزيئات اللزجة المرنة على السطح بسبب التخميد السريع مما يؤدي إلى زيادة قيم التبديد. تم احتضان الجسيمات النانوية الخالية من الذهب المركبة مسبقا باستخدام Slp1 وتحليلها بواسطة SDS-PAGE التي تحققت من بيانات QCM-D التي أظهرت أن الجسيمات النانوية لا تزعج بنية Slp1.

يظهر امتصاص الجسيمات النانوية المعدنية الخالية من الذهب المركبة مسبقا لتجارب QCM-D في مخططات دلتا F-delta D وكملامح سمك وكتلة. تظهر هنا شبكة البروتين ل Slp1 المعاد بلورها على أجهزة استشعار معدلة متعدد الكهارل. تم تحديد ثابت الشبكة على أنه 13 إلى 14 نانومتر ووجد أن سمك الطبقة 10 زائد أو ناقص نانومترين.

تحققت دراسات AFM أنه بعد التفاعل الذهبي الثلاثي ، ظلت شبكة Slp1 سليمة تماما مما يؤكد نتائج QCM-D التي تنبأت باستقرار الطلاء. يتحقق AFM من امتصاص الجسيمات النانوية الصفرية للذهب على شبكة Slp1 ولكن نظرا لحجم الجسيمات ، فإنها لا تتبع تناظر p4 ل Slp1. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في غضون يوم عمل واحد إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

باتباع هذه الطرق ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء أو الفحص المجهري لأيون الهيليوم للإجابة على مزيد من الأسئلة مثل مشاهد ربط محددة أو التفاعل مع الجسيمات النانوية الذهبية أو الذهبية. مهدت التقنية المقدمة الطريق أمام الأزراخيم لدراسة تفاعلات الجزيئات الحيوية مع المعادن ، وعلى سبيل المثال سلوك الامتزاز والتخلص على أنواع مختلفة من الأسطح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية التحقيق في تفاعلات المعادن مع المذيبات البيولوجية ، ويرجى عند استخدام هذه الطريقة ، لا تنس استخدام النظارات الواقية ومعطف المختبر وبالطبع القفازات أيضا.