ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا المحاكاة البيولوجية: رواية Biorubber يخلق معرف الصغرى، وعلى نطاق والماكرو-البنى في الكولاجين الهلاميات المائية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو هندسة سقالات الكولاجين ثلاثية الأبعاد التي يمكن أن تشبه السمات المعمارية والتكوين والخصائص الميكانيكية للأنسجة في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة ، مثل تفاعلات خلايا ECM ، وتأثير الميزات المعمارية في إنشاء الأنسجة الهندسية ، وتطوير بدائل الأنسجة ، من بين أمور أخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر إجراء قابلا للتطبيق لتلخيص الهندسة الدقيقة لقنوات التدفق الداخلي والمسارات بدقة عالية في مادة قابلة للتحلل.

ستظهر الإجراء فيرونيكا رودريغيز ريفيرا ، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبري. يجب تخزين المواد المستخدمة في تحضير مطاط BSA وحفظها باردة حتى تصبح جاهزة للاستخدام حتى لا يتم تثبيت مطاط BSA قبل الأوان. العقم مهم جدا أيضا لهذا الإجراء.

أولا ، قم بتعقيم الموزع. في غطاء مزرعة غير خلوي ، ضع حلقات O ، والحقنة ، وغطاءها ، وطرف المزيج ، وموزع أربعة إلى واحد. تعقيم هذه المواد بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

أولا ، قم بربط قطعتي القالب المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ معا وقم بإرفاق قفل Luer. قبل تجميع الموزع ، قم برش الماصات والكواشف قبل إدخالها إلى غطاء المحرك بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم أولا بتوصيل غطاء الطرف بحامل المحلول.

بعد ذلك ، قم بتحميل محلول BSA بنسبة 30٪ في الغرفة الأكبر دون تلويث الغرفة الأخرى. اترك مساحة كافية لإرفاق الحلقة O. بعد ذلك ، قم بتحميل غرفة الموزع الأصغر بنسبة ثلاثة بالمائة من الجلوتارالديهايد وقم بإرفاق حلقة O أخرى.

الآن ، قم بتوصيل المحقنة بالموزع. ثم قم بإمالة المجموعة بحيث يكون الغطاء في الأعلى ، واستبدل الغطاء بطرف خلط. ثم اضغط برفق على الجوانب للسماح لفقاعات الهواء بالتحرك لأعلى.

بعد ذلك ، ضع الموزع داخل كيس معقم لاحتواء محلول العادم. في الكيس ، مع وضع الموزع في وضع مستقيم ، قم بتوزيع كمية صغيرة من المحلول لتنظيف كل الهواء من المحقنة. إزالة الهواء مهم جدا.

بعد ذلك ، بسرعة ، قم بتوصيل قفل Luer الخاص بقالب Y المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ بطرف المحقنة. الآن ، مع وجود القالب في يدك غير المهيمنة ، قم بتبديل محلول الإخراج في العادم الأيمن والأيسر لقنوات التدفق. اضغط على العوادم ، وبالتالي ملء الفراغات الداخلية بالمحلول.

بعد ذلك ، ضع القالب أفقيا وحقنه بمزيد من المحلول حتى يتم استخدام نصف حجم الموزع. يجب الآن وضع القالب في طبق ، ملفوفه في بارافيلم ، وتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. يتم تحجيم هذا الإجراء إلى أربعة جرامات من الكولاجين المحمض.

اتركها باردة حتى يتم استخدامها. بعد وزن الكولاجين ، استمر في تعقيم المحلول بإشعاع جاما. أثناء التحضير ، اصنع محلول HEPES عادي طازج 0.2 في الماء.

ثم انقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. اضبط الرقم الهيدروجيني على تسعة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم المركز. تأكد من تعقيم غطاء المحرك بالأشعة فوق البنفسجية وتعقيم الملقط والملعقة والمشرط.

في الغطاء ، امزج 1.5 مل من محلول HEPES مع 1.5 مل من 10x MEM. قم بتخزين هذا الخليط على الثلج. أيضا ، قم بتبريد طبق 12 بئر وحقنة 20 مل في الفريزر لمدة 10 دقائق.

لمزيد من العقم ، قم برش الأنابيب والألواح التي تحتوي على 70٪ من الإيثانول قبل وضعها في الغطاء. رش لوحة القالب وضعها في الغطاء. ثم قم بإزالة قوالب المطاط BSA باستخدام الملقط.

ثم قم بقطع قنوات العادم من القالب باستخدام مشرط. بعد ذلك ، قم بدوامة خليط HEPES-MEM لفترة وجيزة وأضف ملليلترا واحدا إلى الكولاجين. ثم امزج المحلول جيدا بملعقة معقمة.

اتبع بدوامة قصيرة ، وانقل المحلول بسرعة إلى حقنة باردة سعة 20 مل. الآن ، أثناء تثبيت مطاط BSA داخل البئر ، قم بتوزيع نصف محلول هيدروجيل الكولاجين في قاع البئر. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، ضع القالب بحيث تلامس نهايات تدفق المطاط والتدفق جدران البئر.

ثم قم بتغطية القالب بهيدروجيل الكولاجين. الآن ، أغلق البئر بالبارافيلم ، وقم بتحميل اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. اترك ساعة واحدة حتى يتبلمر الكولاجين.

خلال هذا الوقت ، حافظ على ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء المحرك. أيضا ، اضبط جهاز التشابك للأشعة فوق البنفسجية لتوصيل 630،000 ميكروجول لكل سنتيمتر مربع. الآن ، قم برش يديك التي ترتدي القفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بتحميل اللوحة بالقوالب المغطاة بالكولاجين في الرابط المتقاطع ، وابدأ عملية التشعيع.

بعد التشعيع ، رش القفازات مرة أخرى ، وأفرغ اللوحة من الرابط المتقاطع. ثم ، باستخدام ملعقة معقمة ، قم بإزالة الجل من البئر ، واقلبه ، وربط الجزء السفلي من الهيدروجيل. بعد دورة التشابك النهائية ، تابع هضم الإنزيم.

لإزالة مطاط BSA دون إزعاج سقالة الكولاجين ، استخدم محلول التربسين المعقم بنسبة 0.25٪ عند درجة الحموضة 7.8 واضغط عليه من خلال مرشح 0.20 ميكرون. انقل كمية كافية من محلول التربسين المصفى إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. ثم انقل هيدروجيل الكولاجين إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على محلول الإنزيم.

تأكد من أن الهيدروجيل مغطى بالكامل بالمحلول. أغلق الأنبوب بالبارافيلم ، وقم بتدويره برفق لمدة دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، احتضن الأنبوب عند 30 درجة مئوية واترك عملية الهضم لمدة 15 إلى 24 ساعة.

في الساعات الأربع الأولى ، قم بإزالة الأنبوب كل 15 إلى 30 دقيقة وقم بتدويره برفق للمساعدة في إكمال هضم المطاط BSA. في اليوم التالي ، يعتبر الهضم كاملا عندما لا يطفو المطاط في المحلول أو لا توجد قطع معطلة من المطاط في الهيدروجيل. الآن ، استبدل محلول التربسين بمحلول موسكوناس المعقم ، واترك الأنبوب يهتز عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

في وقت لاحق ، استنشق محلول موسكوناس وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين لتنظيف سقالة الكولاجين بالكامل. تم استخدام عدد كبير من الاختبارات لتحسين استخدام المطاط الحيوي ووصفها بالتفصيل في بروتوكول النص. باستخدام البروتوكول المحسن وثلاث قطع من العفن الصلب ، تم تصنيع الهلاميات المائية للكولاجين وفحصها بالتفصيل.

تم تصميم قالب Y المطلوب على آلة Microlution. تم حقن العفن Y بنسبة 30٪ BSA وثلاثة بالمائة من الجلوتارالديهايد ، والذي تفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، تم صب مطاط BSA بالكولاجين وتسخينه إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة.

تم هضم المطاط بالإنزيم لمدة 15 ساعة ، مما أضعفه إلى درجة السقوط دون التأثير على هندسة هيدروجيل الكولاجين. تم قياس قناة التدفق الأربعة ملليمترات التي يلقيها القالب باستخدام الفرجار لتكون أربعة ملليمترات بالضبط في هيدروجيل الكولاجين. عند اختبار استقرار القالب ، وجد أن الأبعاد الصغيرة التي تصل إلى 300 ميكرون يمكن هندستها بشكل موثوق.

بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار السقالات بحثا عن الجلوتارالديهايد المتبقي بعد غسل موسكوناس ، ولم يتم العثور على أي بقايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع سقالات الكولاجين ثلاثية الأبعاد مع إمكانية تقليد الأشكال الهندسية في الجسم الحي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى تكمل هذه التقنية ، مثل إنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد للأنسجة في الجسم الحي وتصنيع قوالب ذات ميزات معمارية محددة للإجابة على أسئلة إضافية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف التفاعل بين الميزات المعمارية الداخلية ومكونات المصفوفة مع الخلايا في النماذج المختبرية.