توصيف الأنسجة بعد طريقة جديدة تصنيفها فيما يتعلق الجلد الصغرى الطعوم الجيل

الهدف العام من هذا الاختراع الجراحي هو إنتاج طعوم جلدية دقيقة ذاتية تكون جاهزة للاستخدام الفوري في نفس العملية الجراحية لأغراض التئام الجروح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الطب التجديدي وهندسة أنسجة الجلد حول قضايا مثل التئام الجروح المزمنة، والحروق، والقرح الناتجة عن الإصابات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في سهولة استخدامها من قبل الطبيب دون الحاجة إلى تقنيات متخصصة، بالإضافة إلى كونها سريعة ومنخفضة التكلفة.

للبدء، استخدم مخرز الخزعة لجمع عينات جلدية من المريض. ثم قم بإزالة الطبقة الطلائية والتخلص منها. امزج كل عينة نسيجية مع 1 milliliter من المحلول الملحي لإنتاج طعوم مجهرية ذاتية.

لتحضير المعقدات الحيوية للتطبيق السريري، انقل 1 milliliter من محلول الطعم الدقيق إلى إسفنجات الكولاجين. ضع المعقد الحيوي فوراً على المنطقة المصابة من المريض. وللإجراءات المختبرية، اختبر حيوية المعقد الحيوي.

بعد ثلاثة أيام من الزرع، صب فورمالين بتركيز 0.3% مباشرة على المجمعات الحيوية (biocomplexes) وثبتها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم الميكروتوم لتقطيع مقاطع بسمك 5 micrometers وثبتها مباشرة على شريحة زجاجية. ثم ضع المقاطع في 15 إلى 20 milliliters من الزيلين لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك، اغمر الشرائح في درجات تنازلية من الإيثانول لمدة ساعة واحدة لكل درجة، قبل وضعها في ماء منزوع الأيونات لإزالة البارافين وإعادة ترطيب المقاطع. ثم استخدم من 1 إلى 2 ملليلتر من الهيماتوكسيلين بتركيز 1 جرام لكل لتر لمدة دقيقة إلى دقيقتين لصبغ المقاطع. وانقلها إلى الماء لشطف الصبغة.

الآن، وباستخدام 1 إلى 2 مللي لتر من 1%Eosin Y و 70%ethanol مخففة في الماء، صبغ المقاطع لمدة تتراوح من أربع إلى خمس دقائق. بعد ذلك، استخدم مياه الصنبور الجارية لشطف الشرائح. غمر المقاطع في تركيزات متزايدة من ethanol لمدة ساعة واحدة لكل تركيز قبل تحضينها في xylene لمدة ساعة واحدة.

أخيرًا، ضع وسط تثبيت قاعدي على العينات قبل إضافة غطاء الشريحة. ثم افحصها تحت المجهر الضوئي بتكبير 100x. وباستخدام مقطاع الجلد (dermatome)، خذ عينات من الطبقة الحليمية، أو الجلد الميت، أو الأدمة بسمك 0.6 millimeter أو 1 millimeter أو 0.2-millimeter على التوالي، من مناطق الجذع لأربعة متبرعين بأنسجة متعددة تتراوح أعمارهم بين 40 و55 عامًا، وذلك وفقًا للقواعد الوطنية الخاصة بعمليات الحصاد.

ضع العينات في 0.9% NaCl وضعها على هزاز مداري لمدة خمس دقائق لشطف الأنسجة بلطف. وباستخدام مخرزة خزعة بقطر 5 مليمتر، استخلص عينات ذات قطر موحد من أنسجة الجلد، سواء من البشرة أو الأدمة، وقم بوزن جميع عينات الأنسجة. بعد ذلك، أدخل ثماني عينات، أو ثلاث أو أربع عينات موحدة من أنسجة الجلد، من البشرة أو الأدمة على التوالي، في جهاز تفتيت الأنسجة، وأضف 1.5 milliliters من المحلول الملحي لإتمام عملية التفكيك.

قم بإجراء عملية التفكيك لجميع عينات الأنسجة كما هو موضح في هذا الجدول. استخدم عدداً مطابقاً من الخزعات الثقبية المستمدة من عينات أنسجة سليمة كضوابط. بعد التفكيك الميكانيكي، اسحب المحلول الملحي الذي يحتوي على الطعوم الدقيقة وضع كل عينة بشكل منفصل في بئر واحدة من صفيحة ذات 12 بئراً.

أضف 1 milliliter من وسط RPMI-1640 المكمل بـ 10% FBS والمضادات الحيوية إلى كل عينة. ولتقييم حيوية الخلايا، أضف إلى كل بئر 1 milliliter من الوسط الذي يحتوي على 0.5 milligrams per milliliter من محلول MTT، ثم حضن العينات عند 37-degree Celsius و 5% carbon dioxide لمدة ثلاث ساعات. بعد انتهاء فترة التحضين، قم بإزالة وسط MTT واستبدله بـ 1 milliliter من DMSO.

بعد التحضين لمدة 10 دقائق، يتم نقل كل عينة في DMSO إلى كوفت، وباستخدام مقياس الطيف الضوئي يتم قياس الكثافة الضوئية عند 570 نانومتر. تُحسب حيوية الخلايا باعتبارها نسبة الامتصاصية عند 570 نانومتر إلى وزن وجرامات الأنسجة المستخدمة قبل عملية التفكيك. بعد ذلك، وبمجرد سحب المحلول الملحي من أنسجة الجلد، وعينات البشرة والأدمة من متبرع واحد، توضع كل عينة على حدة في بئر من طبق ذي 12 بئرًا لإجراء اختبار حيوية الخلايا أو في قارورة زراعة لإجراء التحليل المورفولوجي.

أضف 1 milliliter من RPMI-1640 مع 10%FBS ومضادات حيوية إلى الطبق ذي الـ 12 بئراً، أو 5 milliliters إلى قارورة الزرع، ثم يتم التحضين عند 37-degree Celsius و5%carbon dioxide لمدة 24 ساعة أو سبعة أيام، على التوالي. بعد مرور 24 ساعة، استخدم المجهر الضوئي لإجراء تحليل مورفولوجي عن طريق تقييم وجود معلق خلوي. كرر العملية في اليوم السابع.

باستخدام تحليل FACS، يتم تحليل عينات الأدمة للكشف عن مؤشرات الخلايا الميزنشيمية والمكونة للدم، مثل CD146 و CD34 و CD45. يُضاف الوسط الغذائي إلى الخلايا المفككة، ثم تُحضن عند 37-degree Celsius لمدة ثلاثة أيام. ويتم تقييم عقم النسيج عن طريق إجراء تحليل ميكروبيولوجي كما هو موضح سابقاً.

كما هو موضح هنا، تم زرع طعوم دقيقة ذاتية بشرية محملة فوراً على دعامة كولاجين في آفة بالساق. ولوحظ حدوث إعادة طلانية كاملة مرتبطة بإصلاح الأنسجة بعد 30 يوماً. علاوة على ذلك، أظهر المتابعة السريرية ملمساً جيداً وليونة في المنطقة المتضررة بعد خمسة أشهر.

كما هو موضح في هذا الجدول، تم تحديد عتبات ثماني وأربع وثلاث خزعات يمكن معالجتها في خطوة واحدة، وتم تفكيك الأنسجة في أربعة أوقات مختلفة من أجل تحديد الظروف المثلى للتفكيك للحفاظ على حيوية خلوية جيدة. وقد أظهر التفكيك الميكانيكي الموضح في هذا الفيديو الحفاظ على قيمة متوسطة لحيوية الخلايا بنسبة 30% في جميع عينات الجلد، سواء البشرة أو الأدمة، عند تقييمها في أوقات مختلفة بالنسبة للنسيج السليم. ويوضح هذا الرسم البياني أنه بعد 24 ساعة، أو سبعة أيام في المزرعة، لم يُلاحظ أي تباين جوهري في حيوية الخلايا في عينات أنسجة الجلد بحلول وقت التجانس في المزرعة مقارنة بوقت البدء.

ومع ذلك، لوحظ انخفاض في حيوية العينات الميتة بعد 24 ساعة من الزرع مقارنة بوقت البدء. ولكن استُعيدت حيوية الخلايا بعد سبعة أيام من الزرع. كما لوحظت نتائج مماثلة بالنسبة للأدمة.

عند إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون خمس دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر إزالة الطبقة الظهارية من الجلد. وبعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تفكيك الأنسجة العظمية للإجابة على تساؤلات أخرى مثل آلية التئام العظام.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي وهندسة الأنسجة لاستكشاف التئام الأنسجة لدى المرضى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية الطعم المجهري هذه. لا تنسَ أن التعامل مع الأنسجة قد يكون خطيراً للغاية.

ويجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء نظارات السلامة، دائمًا أثناء تنفيذ هذا الإجراء.