إنشاء الجينوم تحريره المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية: من استهداف لعزل

الهدف العام من هذا الإجراء هو الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام تقنية تحرير الجينوم الحديثة. على الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الخلايا الجذعية ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا لتسهيل نمذجة الأمراض البشرية في بيئة محددة وراثيا. بشكل عام ، سيحتاج الأفراد الجدد في هذه الطريقة إلى ممارسة عزل المستعمرات قبل أن يصبحوا بارعين.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا ضروريا لأن تحديد المستعمرات وقطفها قد يكون صعبا. ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في وسائط hESC على صفيحة مكونة من ستة آبار تحتوي على الخلايا الليفية الجنينية المعطلة للفأر الميتومايسين C ، أو الخلايا المغذية MEF المزروعة على الجيلاتين. كل يوم لاحق بعد الطلاء، حتى تصل hPSCs إلى التقاء 50٪، استخدم ماصة زجاجية وفراغ لإزالة الحجم الكامل للوسائط.

استبدل بثلاثة ملليلتر من وسائط hESC الدافئة لكل بئر. قبل يوم واحد من الاستهداف ، قم بإزالة وسائط hESC وأضف وسائط hESC جديدة مسخنة مسبقا مكملة ب 10 ميكرومولار Y-27632. أيضا ، قم بإعداد واحد إلى لوحين من ستة آبار من خلايا التغذية MEF المقاومة للأدوية من الفئران DR4.

في يوم الاستهداف ، قم بإعداد محاليل النقل عن طريق سحب خمسة ميكروغرامات من البلازميد 1 و 2 لتعبير نوكلياز إصبع الزنك ، أو بلازميد التعبير TALON 1 و 2 ، أو 15 ميكروغراما من CRISPR cas9 px330 الذي يشفر البلازميد في أنبوب واحد خمسة ملليلتر. أضف 30 ميكروغراما من بلازميد المتبرع الذي تم إصلاحه ، متبوعا بما يكفي من محلول ملحي مخزن بمقدار 1x من الفوسفات لرفع الحجم إلى 300 ميكرولتر. افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من التقاء بنسبة 50٪.

بعد ذلك ، استخدم ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية لإزالة الوسائط من لوحة مركبات الكربون الهيدروفلورية ، ثم اغسل الخلايا ب 2 ملليلتر من 1x PBS الدافئ. بعد شفط PBS ، أضف صفر نقطة خمسة ملليلتر من محلول 0.25٪ Trypsin-EDTA مباشرة على الخلايا. ضعها في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق تقريبا ، أو حتى تبدأ طبقة التغذية في الرفع عن اللوحة.

بعد الحضانة ، أضف ملليلترين من وسائط الغسيل الدافئة ES إلى كل بئر لإيقاف تفاعل التربسين. اجمع الخلايا من كل بئر ، مع التأكد من أن الخلايا المغذية تخرج على شكل ورقة. قم بتجميع محتويات كل بئر في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 ملليلتر ، يجمع بين جميع الآبار ويقوم بثلاثية الخلايا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر.

أضف وسائط غسيل ES لرفع تعليق الخلية إلى 40 ملليلترا. انتظر من دقيقة إلى دقيقتين للسماح لقطع التغذية الكبيرة بالاستقرار في قاع الأنبوب ، ثم قم بإزالة المادة الطافية ، باستخدام ماصة مصلية ، وقم بإيداعها في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلترا. بعد الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة خمس دقائق عند 190 مرة جم ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج لوحة الخلايا.

أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من 1x pbs. اجمع بين الخلايا المعلقة مع محلول قطع البلازما المحضر مسبقا. قم بتقطيع الخلايا وخليط التعداء في كوفيت كهربائي بأربعة ملليمترات ، وضعها على الجليد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.

اضبط معلمات البرنامج الأسي على نظام التثقيب الكهربائي على 250 فولت ، و 500 ميكروفاراد ، ومقاومة لا نهائية ، وحجم كوفيت بأربعة ملليمترات. قم بتكليف الخلايا بالكهرباء ، ثم ضع الكوفيت مرة أخرى على الجليد لمدة ثلاث دقائق. أعد تعليق الخلايا المثقلة بالكهرباء في 18 مل من وسائط hESC الدافئة ، مكملة ب 10 ميكرومولار Y-27632.

افحص DR4 MEFs تحت المجهر. ضع ثلاثة ملليلتر من معلق الخلية المفردة في كل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار تحتوي على خلايا تغذية DR4 ، والعودة إلى الحاضنة. في اليوم الثالث بعد الطلاء ، استبدل الوسائط الموجودة على وسائط hESC للخلايا بدون Y-27632.

في اليوم الرابع، استبدل الوسائط غير المكملة بوسائط تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. يستخدم بورومايسين هنا. في اليوم السابق لقطف المستعمرة ، قم بإعداد صفيحة واحدة مكونة من 12 بئرا من خلايا التغذية MEF لكل مستعمرة يتم قطفها.

في اليوم 12 بعد الطلاء ، افحص اللوحة تحت مجهر التشريح. حدد المستعمرات التي يتراوح قطرها من 800 إلى 1 ، 200 ميكرون والجاهزة للقطف. تأكد من أن هذه المستعمرات لا تحتوي على خلايا بدأت في التمايز ، مثل تلك الموضحة هنا.

تأكد أيضا من أن الخلايا تعبر عن GFP. في يوم الانتقاء ، افحص MEFs تحت المجهر للتأكد من صحتها. قم بإزالة جميع الوسائط من ألواح خلايا التغذية MEF ، واستبدلها بمليلتر واحد من وسائط hESC.

أيضا ، قم بتغيير وسائط hESC على لوحات hPSC ذات الستة آبار التي سيتم اختيارها. بعد ذلك ، اسحب الماصات الزجاجية لقطف المستعمرات. لاختيار المستعمرات ، ضع أولا مركبات الكربون الهيدروفلورية على مرحلة مجهر التشريح في غطاء مزرعة الأنسجة ، وقم بتجميع جهاز الانتقاء عن طريق وضع طرف الماصة الزجاجية في لمبة الشفط.

حدد المستعمرة المراد قطفها ، وضع طرف الماصة الزجاجية المسحوبة فوق المستعمرة. بعد ذلك ، قم بضغط لمبة جهاز الانتقاء لاستئصال المستعمرة برفق وتقطيعها إلى 10 إلى 20 قطعة متساوية الحجم. بعد ذلك ، ارسم القطع المقطوعة من المستعمرة في الماصة عن طريق تحرير المصباح.

حاول أن تأخذ أقل قدر ممكن من الوسائط أثناء النقل. ضغط المصباح لنقل المستعمرة المكسورة الآن مباشرة إلى بئر واحد من لوحة خلية مغذية MEF مكونة من 12 بئرا. قم بتسمية كل بئر للسماح بالتعرف الفريد على المستنسخة المشتقة من خلية واحدة.

قم بتغيير الماصة الزجاجية وكرر الإجراء للمستعمرة التالية. أعد الألواح إلى الحاضنة ، وهز الألواح برفق لتفريق الخلايا في البئر. في اليوم التالي ، قم بإزالة الحجم الكامل للوسائط ، واستبدلها بنقطة واحدة وخمسة ملليلتر من وسائط hESC الدافئة.

كرر لمدة 10 إلى 12 يوما حتى تتماسك الخلايا بنسبة 50٪. بعد 10 إلى 12 يوما ، افحص hESCs تحت النطاق. اختر مستعمرة إلى مستعمتين من كل بئر ، وانقلها إلى ألواح خلايا مغذية MEF جديدة مكونة من 12 بئرا لإنشاء لوحة طبق الأصل.

استخرج الحمض النووي من المستعمرات المتبقية في كل بئر من الصفائح الأصلية للتنميط الجيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل أو اللطخة الجنوبية. ويبر تم استهداف ثلاث خلايا جذعية جنينية بشرية في موضع AAVS1 باستخدام نوكليازات خاصة بالموقع وقالب إصلاح لتقديم مراسل EFFP وشريط مقاومة بورومايسين. تظهر هذه الصور التمثيلية مستعمرات تم تحريرها باستخدام نوكليازات أصابع الزنك ، و TALENs ، و CRISPR / Cas9.

تظهر نتائج التنميط الجيني التمثيلي ل PCR استنساخا مستهدفا غير مستهدفة وغير متغايرة الزيجوت ومتماثلة اللواقح باستخدام نوكليازات إصبع الزنك و TALENs و CRISPR / Cas9 جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم من النوع البري. يوضح هذا الجدول عمليات التكامل التي تم التحقق منها من تفاعل البوليميراز المتسلسل في موضع AAVS1 لكل نوكلياز خاص بالموقع في هذه التجربة ، مقارنة بعمليات التكامل الفردية المناسبة التي تم التحقق منها في التجارب السابقة. أسفرت CRISPR-Cas9 عن أكثر المستنسخة استهدافا بشكل صحيح ، في حين أن منصة TALEN تحتوي على أكثر المستنسخة استهدافا بشكل متماثل اللواقح.

بمجرد إتقانها ، تستغرق هذه التقنية حوالي ثلاث إلى خمس ساعات من التدريب العملي ، ويمكنك الحصول على خلايا محررة في غضون ثلاثة أسابيع تقريبا من بدء التجارب. من المهم حقا مع هذه التقنية العمل بأمان ، واستخدام تقنية معقمة في جميع الأوقات. بعد التلاعب الجيني ، يمكنك أن ترى كيف يؤثر على أنواع أخرى من الخلايا باستخدام تمايز الخلايا الجذعية إلى أنواع أخرى من الخلايا ، مثل الخلايا العصبية.

تطوير هذا البروتوكول الطريق للباحثين لاستخدام تحرير الجينوم في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لإنشاء نماذج أمراض في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحرير الجينوم في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.