التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

الهدف العام من بروتوكول التصوير هذا هو تصور ديناميكيات الخلايا التائية CD4 الموجبة في الجلد الملتهب. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم المناعة، مثل: ما هي الآليات التي تكمن وراء حركة الخلايا المناعية ووظيفتها في الأنسجة الملتهبة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر طريقة غير باضعة لدراسة السلوك الديناميكي للخلايا التائية CD4 In Situ.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات تحضير الأذن للتصوير، كما أن الوضع الصحيح للأذن ضروري لالتقاط صور عالية الجودة. أنا أليسون غايلو، طالبة دراسات عليا، وسأقوم بتقديم العرض التوضيحي لهذا البروتوكول. ابدأ بسحب 300 µL من معلق الخلايا التائية المؤثرة الموصومة فلورياً لكل فأر في سرنجة مجهزة بإبرة قياس 27.5 gauge.

بعد ذلك، اقلب المحقنة بحيث تكون جهة الإبرة للأعلى، وانقر برفق على جسم المحقنة، مع تحريك المكبس للأعلى والأسفل حسب الضرورة لإزالة أي فقاعات. وعندما تصبح الخلايا جاهزة، انقل الفئران إلى قفص نظيف، وضعها تحت مصباح حراري حتى تتوسع أوردة الذيل. ثم انقل الفأر الأول إلى أداة التثبيت، وامسح الذيل بمسحة كحولية.

بعد تحديد الوريد الذيلي الجانبي، احقن 200 microliters من الخلايا ببطء في الوريد. وعند نقل جميع الخلايا، اسحب 50 microliters من مستحلب الفلورسين الكامل في سرنجة أنسولين عيار 28.5، واضغط بقوة على المكبس لإزالة أي فقاعات هواء كبيرة. ثم ضع كشتباناً على إصبع السبابة الأيسر، وأمسك أذن الفأر بعناية بين الإبهام الأيسر والكشتبان، بحيث يكون الجانب البطني للأذن متجهاً للأعلى.

بعد ذلك، قم بإدخال الإبرة، بحيث يكون الجانب المائل للأعلى، في الأدمة في الثلث الخارجي من صيوان الأذن، وبإزاحة طفيفة عن المركز، ثم احقن ببطء 10 µL من المستحلب في النسيج. وبعد حقن جميع الحيوانات، راقب الفئران حتى تتعافى تماماً. وبعد ثلاثة أيام من التحصين، قم بتوسيع الأوعية الدموية في أوردة الذيل للحيوانات المحقونة كما تم توضيحه للتو.

بعد التخدير، قم بتثبيت ذيل الفأر الأول باستخدام ملقط. امسح الذيل بمسحة كحولية، ثم مرر بعناية قسطرة إبرة مقاس 30.5 في الوريد الجانبي للذيل، مع التحقق من نفاذيتها عن طريق الضغط بلطف على مكبس المحقنة. عند استقرار القسطرة في مكانها، ضع قطرة إلى قطرتين من لاصق الأنسجة سيانوأكريلات (cyanoacrylate) على موقع الحقن، واترك اللاصق ليجف لمدة 30 ثانية تقريباً.

بعد ذلك، استخدم مقصاً لتقليم الشوارب والشعر من الجزء الخلفي وجوانب الأذن بعناية. ثم استخدم مسحة قطنية لترطيب السطح الداخلي للأذن باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بتدوير الفأر، وبسط الأذن المحقونة على شريحة زجاجية غطاء (glass cover slip) مقاس 24 by 50 millimeter ورقم 1.5، حتى تصبح ملاصقة تماماً للزجاج.

قم بتجفيف فائض محلول PBS. بعد ذلك، استخدم زوجين من الملاقط المنحنية للإمساك بقطعة من الشريط القماشي بطول 20 مليمتر تقريباً بشكل طولي من الزوايا العلوية، وضع طرف الشريط السفلي على غطاء الشريحة عند الجزء العلوي من أذن الفأر. قم بلف الشريط فوق بقية الأذن، مع إزاحة الشعر الزائد باستخدام الملاقط حسب الضرورة، واستخدم مسحة قطنية جافة للضغط بلطف على الشريط حول الأذن لضمان إغلاق محكم، مع الحرص على عدم الضغط على الأذن نفسها.

من الضروري تثبيت الأذن بالشريط اللاصق بشكل صحيح على غطاء الشريحة مع ضمان إحكام الغلق من كلا الجانبين وبأقل قدر ممكن من فقاعات الهواء، حيث سيؤثر ذلك على جودة الصور التي يمكن الحصول عليها. الآن، قم بتثبيت منصة تصوير المجهر الفلوري على كتلة تسخين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، وضع شحم الفراغ على كلا جانبي منطقة الأذن في المنصة. قم بتدوير الفأر لوضع غطاء الشريحة على المنصة، مع الحرص على محاذاة الأذن في مركز اللباد.

عندما تصبح الأذن في مكانها، قم بتثبيت مخروط أنف الإيزوفلوران في الحامل الموجود على المنصة، مع التأكد من أن المخروط مثبت بإحكام ويغطي أنف الفأر بالكامل. ثم استخدم مسحة قطنية للضغط بقوة وبحذر على غطاء الشريحة فوق منصة التصوير، مما يؤدي إلى توزيع الشحم المفرغ تحت غطاء الشريحة. لف قطعتين من الشريط اللاصق بطول 20 millimeter وقطعتين أطول حول الجزء العلوي من المنصة لتثبيت غطاء الشريحة بالمنصة.

بعد ذلك، انقل الفأر إلى منصة المجهر. قم بتثبيت المنصة بمزيد من الشريط اللاصق، وضع طبقة مزدوجة من شحم الفراغ فوق شريحة التغطية حول الأذن. ثم لف بطانية تدفئة مملوءة بالماء حول الفأر، واملأ خزان شحم الفراغ بماء مقطر بدرجة حرارة 37 degrees Celsius.

بالنسبة للتصوير المتقطع (time lapse) داخل الجسم الحي (In Vivo)، ابدأ بوضع العدسة الشيئية فوق مركز الأذن، ثم اخفض العدسة حتى تلامس سطح الماء في الخزان. بعد ذلك، وباستخدام مصدر ضوء خارجي، اخفض العدسة ببطء حتى يتضح تركيز سطح الأذن. ثم قم بإنزال الستائر الداخلية والخارجية حول منصة المجهر، واضبط الطول الموجي لليزر على 900 nanometers في نافذة وحدة تحكم ليزر MP، وقدرة الليزر في نافذة إعدادات الاستحواذ لليزر، وجهود PMT في نافذة التحكم في استحواذ الصور.

في نوافذ الحجم والوضع بإعدادات الاستحواذ، اضبط المجهر على دقة 512 × 512 بكسل، مع زمن بقاء قدره 2 microsecond لكل بكسل، واختر XY repeat لتفعيل وضع التصوير الحي للمسح عبر النسيج. وبمجرد تحديد مجال التصوير المناسب، حدد أعلى خلية في الأدمة، وانقر فوق زر set zero لضبط الموضع Z على الصفر. ثم قم بالتمرير للأسفل في اتجاه Z لقياس مدى عمق الخلية.

ثم قم بتحديد مواضع البداية والنهاية في نافذة إعدادات الحصول على الصور في المجهر، واضبط جهود PMT في الجهاز وقوة الليزر في نافذة Z الساطعة لتحسين رؤية الخلايا عبر عمق مجال التصوير. قم بتفعيل خياري العمق والوقت، واضبط مرشحاً مشتركاً لمسح الصورة ثلاث مرات لكل خط في نافذة وضع مرشح التحكم في الحصول على الصور. اضبط عمق شريحة Z في نافذة مجهر الحصول على الصور بحيث يستغرق التقاط مجموعة كاملة من الصور دقيقة واحدة تقريباً، كما هو موضح في نافذة عرض الوقت.

بعد ذلك، ولتقييم استقرار النسيج، اضبط عدد التكرارات على خمسة في نافذة إعدادات المسح الزمني (time scan) الخاصة بالاستحواذ، ثم انقر على زر المسح (scan) لالتقاط صورة فاصلة زمنياً للمنطقة لمدة خمس دقائق. إذا كان النسيج مستقراً بعد مرور خمس دقائق، اضبط عدد التكرارات ليكون بين 30 و 45 في نافذة إعدادات المسح الزمني، وقم بجمع صورة فاصلة زمنياً لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة، مع مراقبة أي انزياح طفيف في النسيج أثناء جمع الصورة. احفظ الصورة المأخوذة قبل إضافة الأجسام المضادة بالتنسيق المناسب، ثم اسحب خليط الأجسام المضادة في حقنة توبيركولين سعة 1 mL، مع الحرص على إزالة جميع فقاعات الهواء.

اضغط برفق على المكبس بحيث يتكون قطرة من محلول الأجسام المضادة عند طرف الإبرة، ثم ارفع الستائر المحيطة بالمنصة لتحديد موقع القسطرة. استبدل حقنة PBS بحقنة الأجسام المضادة، ثم احقن الأجسام المضادة ببطء داخل القسطرة. عند إتمام حقن الأجسام المضادة بنجاح، أخفض الستائر مرة أخرى ودون وقت الحقن.

بعد ذلك، ابدأ فوراً في جمع تسلسل تصوير جديد لمدة تتراوح من 20 إلى 40 دقيقة، في الموقع نفسه، وباستخدام إعدادات الجهاز ذاتها المستخدمة في صورة ما قبل إضافة الأجسام المضادة. وأخيراً، احفظ ملف صورة ما بعد إضافة الأجسام المضادة بالتنسيق المناسب، ثم قم بإزالة الفأر بعناية من منصة المجهر، مع مراقبة الحيوان حتى يتعافى تماماً. إن تصوير أدمة الأذن السليمة وفقاً لهذا البروتوكول يسهل الحصول على صور عالية الدقة وصور مفرقة زمنياً لديناميكيات الخلايا التائية المؤثرة في الأدمة الملتهبة.

في هذا المقطع المرئي، يمكن ملاحظة الخلايا التائية المؤثرة المنقولة بالتبيّن، والمصبوغة باللون الأخضر، وهي تتحرك في جميع أنحاء النسيج الجلدي. ومع ذلك، بعد إعطاء الأجسام المضادة المانعة لـ entogrin من نوع antibeta one و antibeta three عبر القسطرة، تتوقف الخلايا التي كانت متحركة سابقاً داخل الأدمة. وتظهر الخلايا انخفاضاً في متوسط السرعة بعد إعطاء الأجسام المضادة، بالإضافة إلى انخفاض ملحوظ في مؤشر التعرج الخاص بها.

أي أن ذلك يمثل نسبة الإزاحة الكلية إلى إجمالي طول المسار. يمكن أن تؤدي الفلورة الذاتية الناتجة عن بصيلات الشعر، والتظليل والفلورة الذاتية الناتجة عن الشعر الموجود في الأعلى، وفقاعات الهواء المحتبسة بين سطح الأذن وغطاء الشريحة، جميعها إلى ظهور عيوب تصويرية تحجب رؤية الخلايا T وتتداخل مع برنامج تحليل الصور الآلي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي استخدام مصادر متعددة للحرارة إلى حدوث مشكلات في استقرار الأنسجة، مما يتسبب في تذبذبات كبيرة أثناء التصوير تجعل تفسير النتائج أمراً صعباً.

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تصوير خلايا CD4 T في الأدمة خلال ساعتين إلى ثلاث ساعات، شريطة تنفيذ الإجراء بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر اتباع الإرشادات المناسبة لرعاية الحيوانات واستخدامها عند التعامل مع الفئران. يمكن تكييف هذا الإجراء لتصور مجموعات فرعية أخرى من خلايا T أو أنواع أخرى من الخلايا المناعية في الأذن، باستخدام نماذج عدوى مختلفة، أو طرق مختلفة لتحفيز الالتهاب.

بعد تطويره، مهد التصوير الحي (intravital imaging) الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف ديناميكيات الاستجابات المناعية الجارية في الحيوانات الحية. لا تنسَ أن العمل باستخدام ليزر متعدد الفوسفور قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل التدريع المناسب، أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز الالتهاب في أدمة أذن الفأر، وكيفية استخدام التصوير الحي لالتقاط صور الفاصل الزمني لنشاط خلايا CD4 T قبل وبعد إعطاء الأجسام المضادة.