توليد "أنسنة" ذبابة الفاكهة S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

الهدف العام من هذه التجربة هو توليد ذبابة الفاكهة S2 خط خلوي حساس لمثبطات الجزيئات الصغيرة لمحرك كينيسين 5 ، بحيث يمكن استخدامها لدراسة تصحيح الخطأ. تصحيح الخطأ أثناء انقسام الخلية هو عملية يتم فيها إزالة التفاعلات الحركية والأنابيب الدقيقة الخاطئة ، لمنح الخلية فرصة ثانية ، أو فرصة أخرى ، لتشكيل مرفقات مناسبة بحيث يمكن بعد ذلك فصل الجينوم بشكل صحيح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، المتعلقة بعملية تصحيح الخطأ.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا استخدام ذبابة الفاكهة S2 التي تحتوي على عدد أقل من الكروموسومات ، وحساسة لمثبط كينيسين 5 ، وكلاهما يسهل تصور أحداث تصحيح الخطأ الفردية. بدءا من قارورة 25 سم مربع مستزرعة مسبقا من 100٪ GFP-Alpha Tubulin تعبر عن خلايا S2 ، انقل ملليلترين من المزرعة إلى طبق 35 ملم. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا حتى تصبح شبه تلتصق.

قم بإزالة الوسيط من الطبق ، وأضف ملليلترا واحدا من وسط شنايدر ، المكمل ب FBS ، إلى ميكروغرامين من هيكل Eg5-mCherry وكاشف التعداء لنقل الخلايا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. استخدم Parafilm لإغلاق الطبق ، واحتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط شنايدر وأعد الخلايا إلى الحاضنة.

في اليوم الثالث بعد التعدي ، انقل 500 ميكرولتر من الخلايا المنقولة إلى طبق جديد لزراعة الأنسجة سعة 35 ملم يحتوي على 1.5 مل من وسط شنايدر لإجراء تحريض اختباري. للحث على التعبير عن Eg5-mCherry ، أضف كبريتات النحاس إلى التركيز النهائي البالغ 500 ميكرومولار. أغلق الطبق في بارافيلم واحتضنه عند 25 درجة مئوية طوال الليل.

ضع زلة غطاء مطلية ب Concanavalin A معدة مسبقا مقاس 22 ملم × 22 ملم في طبق ثقافة أنسجة نظيف مقاس 35 ملم. ثم قم بزرع 500 ميكرولتر من الخلايا المستحثة بنسبة 100٪ على زلة الغطاء ، واسمح للخلايا بالالتصاق في درجة حرارة الغرفة. للتحقق من تعبير Eg5-mCherry ، قم بتجميع شريحة الغطاء في غرفة ورد ذات وسيط وصورة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجهر مضان ، وفقا للإرشادات الواردة في بروتوكول النص.

بعد التأكد من أن الخلايا تعبر عن كل من Eg5-mCherry و GFP alpha tubulin ، انقل ما تبقى من الخلايا المنقولة وغير المستحثة إلى قارورة زراعة الأنسجة 25 سم مربع ، تحتوي على أربعة ملليلتر من وسط شنايدر. أضف Blasticidin S HCL بتركيز نهائي قدره 25 ميكروغرام لكل مليلتر إلى القارورة ، واستمر في تقسيم الخلايا في وجود Blasticidin S HCL حتى يتوقف موت الخلايا. بعد تحضير الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة KLP61F وفقا لبروتوكول النص ، تعبر خلايا البذور S2 عن Eg5-mCherry في طبق استزراع 35 ملم عند التقاء 25٪ ، والسماح لها بالالتصاق لمدة ساعة واحدة.

قم بإزالة الوسيط من الأطباق وأضف ملليلترا واحدا من وسط شنايدر الخالي من المصل إلى خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي الريبي KLP61F مزدوج الشريطة. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، أضف ملليلترا واحدا من وسط شنايدر مع 10٪ FBS. احتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية.

بعد 24 ساعة من العلاج ب dsRNA ، قم بتحفيز التعبير عن Eg5-mCherry عن طريق إضافة كبريتات النحاس إلى التركيز النهائي البالغ 500 ميكرومولار. احتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إضافية. لإجراء تصوير الخلايا الحية ، ضع غطاء Concanavalin A المطلي مقاس 22 ملم × 22 ملم في طبق ثقافة أنسجة نظيف مقاس 35 ملم.

قم بزرع 500 ميكرولتر من الخلايا المعالجة dsRNA التي تم تحفيزها بين عشية وضحاها على زلة الغطاء ، واسمح لها بالالتصاق لمدة ساعة تقريبا. بعد جمع صور الفاصل الزمني للمغازل ثنائية القطب وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة الوسيط من غرفة الورد وأضف وسيط شنايدر الذي يحتوي على STLC ميكرومولار واحد واستبدل وسيط STLC مرتين أخريين ، وتخلص من الوسط بعد كل غسل لتصور انهيار المغزل. لغسل الدواء وانهيار المغزل العكسي ، قم بإزالة الوسط المحتوي على STLC بعناية من حجرة الورد وتخلص منه في حاوية نفايات ، واستخدم إجمالي 6 إلى 8 ملليمترات من وسط شنايدر لغسل الخلايا أربع مرات ، وتخلص من الوسائط بعد كل غسلة.

ثم بعد إضافة وسيط جديد لإعادة ملء الغرفة ، استمر في التصوير. للوصول إلى وسيط غسل المخدرات وغسلها ، قم بإزالة زلة الغطاء العلوي بعناية من حجرة الورد أثناء تثبيتها على المجهر. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طبق بتري ذو قاع زجاجي معالج ب Concanavalin A على غرار زلات الغطاء لتصوير الخلايا الحية.

بعد زرع 500 ميكرولتر من خلايا S2 المعالجة ب KLP61F dsRNA على زلة غطاء Concanavalin A والسماح للخلايا بالالتصاق ، أضف 1.5 مل من وسط شنايدر ليصل الحجم النهائي إلى ملليلترين. بمجرد القبض على الخلايا في الانقسام الفتيلي وفقا لبروتوكول النص ، أضف STLC ميكرومولار واحتضانه لمدة ساعة واحدة للسماح بتكوين أحادي القطب. اغسل STLC باستخدام ملليلترين من وسط شنايدر الطازج لشطف زلات الغطاء ثلاث مرات.

لإصلاح الخلايا في نقاط زمنية مختلفة لتكوين المغزل ثنائي القطب ، ولتقييم مواقع التعلق الحركية ، ابدأ باستخدام ملليلترين من 1X BRB80 لشطف زلات الغطاء بسرعة. في غطاء كيميائي ، أضف ملليلترين من 10٪ PFA في 1X BRB80 ، واحتضنه لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، لاختراق الخلايا ، أضف 1٪ Triton X في 1X PBS واحتضانه لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم ملليلترين من 0.1٪ Triton X في 1X PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات. بعد ذلك ، انقل زلة الغطاء ، بحيث يكون جانب الخلية متجها لأعلى ، على ورقة من Parafilm في طبق بتري مقاس 150 ملم. أضف 150 ميكرولترا من مصل الحمار المسلوق ، أو BDS ، إلى زلات الغطاء ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الكتلة وإضافة 150 ميكرولترا من الأجسام المضادة الأولية المحضرة وفقا لبروتوكول النص قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد غسل الغطاء ثلاث مرات ، أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة Fluoro-4 المخففة في BDS واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بمجرد غسل زلات الغطاء ثلاث مرات ، احتضنها ب 150 ميكرولتر من BDS ، تحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر من DAPI لمدة خمس دقائق.

ثم بعد غسل زلات الغطاء مرتين ، استخدم ثمانية ميكرولترات من وسط التثبيت لتركيب العينة ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل ، على شريحة بحجم ثلاثة بوصات واحدة. استخدم طلاء الأظافر لطلاء الزوايا. أخيرا ، استخدم هدف 100X لتصوير الخلايا ذات المغازل ثنائية القطب التي تعبر عن Eg5-mCherry.

خذ سلسلة Z ، التي تتكون من 30 طائرة على فترات 0.2 ميكرومتر في جميع القنوات. قم بتحليل الحركية والأنابيب الدقيقة بعناية لتحديد حالة التعلق. مطلوب KLP61F لتكوين مغازل ثنائية القطب في ذبابة الفاكهة S2 الخلايا. ومع ذلك ، فإن مثبطات الجزيء الصغير كينيسين -5 غير فعالة ضده.

تظهر هذه الصور أن كينيسين -5 Eg5 البشري يمكنه إنقاذ وظيفة KLP61F في ذبابة الفاكهة S2 الخلايا. عند إضافة مثبط كينيسين 5 ، STLC ، تنخفض المستويات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة للمحرك ، وتنهار المغزل ، مما يؤدي إلى احتكار القطب في الخلايا التي تفتقر إلى KLP61F الداخلي نتيجة نجاح الحمض النووي الريبي I.يوضح هذا الرقم أنه يمكن عكس تثبيط كينيسين 5 عن طريق غسل الدواء ، ويمكن متابعة تعافي المغزل ثنائي القطب بمرور الوقت. عند إزالة المثبط ، يعيد Eg5-mCherry الارتباط بالأنابيب الدقيقة ، ويمكن للخلايا أن تتطور إلى طور ثنائي القطب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد ذبابة الفاكهة S2 خط خلية حساس لمثبط جزيء صغير من كينيسين -5. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي ست ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التخطيط للمستقبل ، لأن هذه الطريقة تتطلب التحضير قبل أيام قليلة.

لا تنس أن العمل مع مثبطات الجزيئات الصغيرة يمكن أن يكون خطيرا ، لذا ارتد القفازات دائما. يمكن إثبات بناء خلايا ذبابة الفاكهة المتوافقة مع البشر من خلال تطبيق تقنيات Crispr-Cas 9 ، واستبدال ذبابة الفاكهة Kinesin-5 بنظيرتها البشرية. يجب أن يؤدي تطوير خلايا ذبابة الفاكهة المتوافقة مع البشر إلى تعزيز فهمنا لتصحيح الخطأ والعمليات الخلوية الأساسية الأخرى في المستقبل.