Name: توليد أنسنة ذبابة الفاكهة S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: تعلم كيفية توليد خط خلايا S2 من ذبابة الفاكهة حساس لمثبطات جزيئية صغيرة لكينيسين-5 باستخدام البناء Eg5-mCherry. تُسهّل هذه الطريقة دراسة تصحيح الأخطاء أثناء انقسام الخلايا.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن نشكر باتريشيا ادز ورث عن هدية من كينيسين-5 بناء. وأيد هذا العمل من منحة المعاهد الوطنية للصحة (5 R01 GM107026) لTJM والبحوث منحة رقم 5 FY13-205 من مارس من مؤسسة مليم لTJM، وكذلك بدعم من مؤسسة تشارلز H. هود، وشركة، بوسطن، MA. لTJM

1. خلايا Transfecting S2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من مثقف سابقا 25 سم 2 قارورة، إضافة α معربا عن تويولين-GFP الخلايا S2 10 إلى الحجم النهائي من 2 مل ب 100٪ confluency، والسماح لهم شبه التمسك الجزء السفلي من 35 ملم صحن زراعة الأنسجة ل حوالي 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من الطبق. Transfect 2 ميكروغرام من Eg5-mCherry بناء 11 مع 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر تستكمل مع 10٪ FBS (المشار إليها فيما يلي باسم سائل الإعلام شنايدر) وترنسفكأيشن الكاشف، بعد بروتوكول الشركة المصنعة. ختم الطبق مع parafilm واحتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر. عودة الخلايا إلى 25 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 بعد ترنسفكأيشن، ونقل 500 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى الجديد 35 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1.5 مل من وسائل الإعلام شنايدر لتحريض الاختبار. حمل تعبيرا عن Eg5-mCherry بإضافة كبريتات النحاس 4 </sub&gt; إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر. ختم طبق في Parafilm واحتضان عند 25 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل كونكانافالين coverslips المغلفة A، ماصة حجم ما يكفي من كونكانافالين حلا (0.5 ملغ / مل المنحل في H 2 O) إلى معطف حمض غسلها ساترة، وإزالة الزائدة، والسماح للساترة للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين المغلفة ساترة في نظيفة 35 مم طبق زراعة الأنسجة، ثم البذور 500 ميكرولتر في 100٪ confluency من الخلايا التي يسببها على ساترة والسماح للخلايا الالتزام لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من Eg5-mCherry التعبير والتجمع ساترة إلى غرفة تعالى (أو وعاء التصوير المناسبة) مع وسائل الإعلام للتصوير في RT على المجهر مضان. استخدام مصادر الضوء المناسبة ومجموعات مرشح لتصور الخلايا. على سبيل المثال، والاداة المستخدمة في هذه الدراسة لديه مصدر الضوء الأبيض الصمام وEGFP (FITC / Cy2) وDSRed (TRITC / CY3) مكعبات التصفية. Eg5-mCherry يموضع إلى الأنابيب الدقيقة وغير المخصب وكالة الطاقة النوويةأقطاب ص المغزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التأكد من أن الخلايا التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، ونقل ما تبقى من transfected الخلايا uninduced إلى 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة التي تحتوي على 4 مل من وسائل الإعلام شنايدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Blasticidin S HCL في تركيز النهائي من 25 ميكروغرام / مل إلى قارورة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل ومواصلة تقسيم في ظل وجود 25 ميكروغرام / مل Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك حتى يتوقف موت الخلايا ويجري التأكد من تحقق للتعبير عن Eg5-mCherry بشكل دوري. احتضان خطوط الخلايا في 25 ° C الحاضنة. ملاحظة: نسبة الخلايا معربا عن زيادات Eg5-mCherry مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة و transfected الخلايا مستقر، والاستمرار في تقسيم في غياب المخدرات وتجميد 12 الخلايا لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 2. RNA التدخل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تضخيم المنطقة BP ~ 500 من Klp61F من كدنا] (LD15641) باستخدام التمهيدي مع إضافة تسلسل T7 المروج (التسلسل الموضح في قائمة المواد) أن يكونتستخدم كنموذج لالرنا المزدوج الجديلة التوليف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل أربع لردود الفعل PCR، 50 ميكرولتر لكل منهما، تحتوي على 100 نانوغرام من الحمض النووي القالب، 25 ميكرومتر لكل التمهيدي، العازلة المناسبة، والبلمرة. ضبط بروتوكول PCR على thermocycler وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للالبلمرة في ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع ونظيفة أربعة تفاعلات PCR باستخدام PCR تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تخزين قالب نظيفة في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزدوج RNA (الرنا المزدوج الجديلة) الذين تقطعت بهم السبل من قالب باستخدام النسخ عدة T7 RNA، بعد تعليمات الشركة الصانعة. نتوقع ~ تركيز 5-15 ملغ / مل من الرنا المزدوج الجديلة. تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضربة قاضية Klp61F مع الرنا المزدوج الجديلة، تسمح للخلايا S2 معربا عن Eg5-mCherry بنسبة 25٪ confluency إلى شبه الانضمام إلى الجزء السفلي من 35 ملم الأنسجة صحن الثقافة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من الأطباق وإضافة 5 ميكروغرام من الرنا المزدوج الجديلة ضد Klp61F (ذبابة الفاكهة كينيسين-5) المخفف في 1 مل من مصل خالية شنايدر &quot;الصورة سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان RT لمدة 1 ساعة، ثم يضاف 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر مع 10٪ FBS. احتضان الخلايا عند 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد العلاج الرنا المزدوج الجديلة، لحث على التعبير عن Eg5-mCherry بإضافة كبريتات النحاس 4 إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر. احتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى. </li></ol> 3. يعيش التصوير خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين ساترة المغلفة في نظيفة 35 مم طبق زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 500 ميكرولتر من الخلايا التي تم التعامل مع الرنا المزدوج الجديلة والتي يسببها O / N على كونكانافالين ساترة المغلفة، وتمكينهم من الانضمام لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع ساترة إلى غرفة تعالى (أو وعاء المناسبة) للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن الخلايا الإنقسامية التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين. ملاحظة: خلايا الميتوزى يعبر فقط GFP-α تويولين ينبغي أن يكون محور دوران أحادي منذ Klp61F، وهو مطلوب للقطبين المغزل، وترسيتها 10،13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الوقت الفاصل بين الصور من مغزل القطبين (على سبيل المثال، 1 الإطار في الدقيقة الواحدة) في الخلايا التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما التصوير، وإزالة وسائل الإعلام من غرفة ردة، واستبدالها مع وسائل الإعلام شنايدر تحتوي على 1 ميكرومتر STLC أكثر من 3 التبادلات الاعلامية متتالية (~ 5 مل الكل) في غرفة لتصور انهيار المغزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبييض المخدرات وعكس انهيار المغزل، وإزالة بعناية وسائل الإعلام التي تحتوي على STLC من غرفة ردة، ويغسل في وسائل الإعلام شنايدر 4X (المجموع 6-8 مل) قبل إعادة تعبئة غرفة ردة للمرة الأخيرة مع وسائل الإعلام الجديدة. مواصلة التصوير. </li></ol> 4. تصحيح الخطأ الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين A coverslips المغلفة إلى 35 ملم أطباق زراعة الأنسجة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 500 ميكرولتر من الخلايا التي تم التعامل مع Klp61F الرنا المزدوج الجديلة على كونكانافالين ساترة المغلفة، والسماح لهم التمسك بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخلايا هي adherالطبعه، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام شنايدر إلى كل طبق لجلب الحجم النهائي لتصل إلى 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء القبض على الخلايا في الانقسام، إضافة MG132 إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى كل من الأطباق، واحتضان لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرومتر STLC واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح لتشكيل القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل STLC قبل الشطف coverslips 3X مع 2 مل من وسائل الإعلام شنايدر جديدة في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips مع وسائل الإعلام شنايدر بالإضافة إلى أية عقاقير الدوائية (على سبيل المثال، أورورا كيناز مثبطات) أو DMSO كعنصر تحكم. ملاحظة: تركيزات مثبط تختلف ويجب تحديد تركيزات النهائي المناسبة من قبل المجرب. مصنوعة حلول الأسهم عادة مثل هذا أن المانع هو تمييع 1: 1000 في وسائل الإعلام. في هذه الحالة 1: 1000 تخفيف من DMSO (أو مذيب مناسب) بمثابة السيطرة على السيارة. نستخدم أورورا B المانع Binucleine 2 بتركيز نهائي 40 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في مختلف نقاط زمنية رس مراقبة تطور تكوين المغزل بين القطبين وتقييم الدول مرفق الحيز الحركي. لإصلاح: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بسرعة لل coverslips مع 2 مل من 1X BRB-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا بإضافة 2 مل من 10٪ امتصاص العرق مخففة في 1X BRB-80 لمدة 10 دقيقة. الماصة لامتصاص العرق بعناية في غطاء الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 1٪ تريتون-X لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح 3X مع 2 مل من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل coverslips جانب خلية تواجه حتى على ورقة من parafilm (استخدام علامة لتسمية Parafilm مناسب لتتبع الشرائح) في 150 مم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لل coverslips مع 150 ميكرولتر المغلي المصل حمار (BDS)، واحتضان في RT لمدة 1 ساعة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. ملاحظة: وهنا، يمكن إيقاف بروتوكول تثبيت أن يستمر في مرحلة لاحقة. ويمكن تخزين Coverslips في غرفة الرطوبة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. لجعل الغرفة الرطوبة، خط حافة طبق 150 ملممع مختبر الرطب يمسح، وتغطي مع غطاء صحن بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كتلة، ولاحتضان coverslips لمدة 1 ساعة على RT مع 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة بشكل مناسب في BDS إلى وصمة عار لkinetochores والأنابيب الدقيقة لتركيزات النهائي من 2 ميكروغرام / مل (أو وفقا لتوصيات الشركة الصانعة) و1 ميكروغرام / مل على التوالي . ملاحظة: وهنا، يمكن إيقاف بروتوكول تثبيت أن يستمر في مرحلة لاحقة. ويمكن تخزين Coverslips في غرفة الرطوبة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips بقوة 3x مع 500 ميكرولتر من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips لمدة 30-60 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق المناسبة المخفف في BDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips بقوة 3x مع 500 ميكرولتر من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips مع 150 ميكرولتر من BDS التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل دابي التركيز النهائي لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 2X مع برنامج تلفزيوني 1X + 0.1٪ تريتون-X، وجبل جoverslips الجانب الخلية أسفل على &quot;الشريحة 3X1 مع 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام. طلاء زوايا بطلاء الأظافر لشل لل coverslips على الشرائح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صورة مع مغزل القطبين التي يتم التعبير عن Eg5-mCherry. اتخاذ سلسلة Z يتألف من 30 طائرة في 0.2 ميكرون فترات في جميع القنوات باستخدام الهدف 100X. تحليل دقيق للkinetochores والأنابيب الدقيقة لتحديد الدول المرفق (bioriented أو المرفقات syntelic). </li></ol>

<ol><li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li>
<li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+a+new+kind+of+tension%3A+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li>
<li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li>
<li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li>
<li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors%3A+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li>
<li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2(2006).</li>
<li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis%3A+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li>
<li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187(2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li>
</ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

تصور تصحيح الخطأ هو أسلوب قيمة لدراسة الخطوات المتبعة في هذه العملية الخلوية الهامة والمعقدة. للقيام بذلك، يتم إنشاء المرفقات الخاطئة باستخدام مثبطات عكسها، ورصدت تصحيح الخطأ على فشل الدواء. وقد تم تطوير هذا الفحص أصلا باستخدام خلايا الثقافة أنسجة الثدييات 5. ومع وجود عدد كبير من kinetochores في العديد من نموذج أنواع خلايا الثدييات يشكل تحديا في مراقبة الأحداث الفردية تصحيح الخطأ. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تمتلك عدد قليل من 4 أزواج من kinetochores، مما يجعلها خط الخلية أكثر الأفضل لمراقبة تصحيح الخطأ. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي هو أن العديد من مثبطات غير فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2. وهكذا، والقدرة على توليد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 أنسنة الإنسان معربا عن كينيسين-5 يوفر أداة قيمة لدراسة تصحيح الخطأ. على الرغم من أن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يمكن أن يكونخط الخلية أفضل لدراسة تصحيح الخطأ، والخطوات المتعددة التي ينطوي عليها الحصول على خط الخلية وهدمت الجينات الأساسية تطرح بعض التحديات التي تواجه هذه التقنية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة جدا. إذا كانت أقل من 20٪ من الخلايا تعبر عن Eg5-mCherry، وينبغي تكرار ترنسفكأيشن كما عملية الاختيار سوف يستغرق وقتا أطول. أيضا، فإن النسبة المئوية للخلايا التعبير عن كل البروتينات الفلورية قد ينخفض ​​مع مرور الوقت. يمكن التغلب على ذلك عن طريق تقسيم الخلايا في وجود Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك وهيغروميسين B لتحديد الخلايا معربا عن Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، على التوالي. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الخلايا ذبابة الفاكهة S2 لها orthologues إلى العديد من البروتينات البشرية و. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحسين ظروف ضربة قاضية للبروتينات الذاتية. قد تختلف الظروف المثلى ضربة قاضية في كمية الرنا المزدوج الجديلة وطول فترة العلاج. وبالنظر إلى ظهور والتحسن السريع للكريسبر-Cas9 تكنولوجىوفاق 15-17، وتوليد خط خلية ذبابة الفاكهة مع الجين Klp61F استبداله Eg5 البشري يقدم بديلا قويا من شأنه التغلب على القيود المفروضة على ترنسفكأيشن ونهج ضربة قاضية. يوضح عملنا أن ذبابة لالبشري استبدال الجينات يجب أن يكون خيارا قابلا للتطبيق في هذه الحالة على الرغم من الكواشف اللازمة للقيام بذلك في خلايا ذبابة الفاكهة S2 يجري حاليا تطويرها. ولا يقتصر هذا الإجراء لEg5، ولكن يمكن تطبيقها على دراسة وظيفة البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. في حالة استخدام مثبطات التي سبق لها أن أنشئت لتكون فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2، هذا البروتوكول يمكن تعديلها لدراسة التأثير المباشر لمثبطات في الخلايا الحية دون القلق بشأن آثار الهدف خارج. ويمكن أيضا أن خط الخلية المنتجة باستخدام هذا البروتوكول أن تستخدم في فحص عالية الإنتاجية تحليل لتحديد الأدوية التي تستهدف البروتينات المحتملة التي ينطوي عليها تصحيح الخطأ.

الفصل المتساوي للجينوم خلال انقسام الخلايا يتطلب التفاعل الصحيح بين الحمض النووي والمغزل الأنابيب الدقيقة منسوخة. الأنابيب الدقيقة التفاعل بأنفسهم مع الكروموسومات من خلال مجموعة متكاملة من البروتينات التي تجمع في القسيم المعروفة باسم الحيز الحركي 1. التوزيع الصحيح للكروموزومات يتطلب أن kinetochores الشقيقة وbioriented، التي يرتبط كل أخت مع الأنابيب الدقيقة النابعة من أقطاب المغزل المعاكس. الحيز الحركي أنيبيب (MT كيلوطن) المرفقات التي ليست في التشكل bioriented يتم بسرعة وكفاءة زعزعة استقرار لإتاحة الفرصة لإقامة biorientation في عملية تعرف باسم تصحيح الخطأ. مقايسة تصحيح الخطأ الذي أنشئ في السابق خلايا الثدييات 5 يتطلب تجميع مغزل أحادي باستخدام مثبطات جزيء صغير عكسها ضد Eg5 (كينيسين-5). العلاج من تعاطي المخدرات يولد العديد من المرفقات syntelic الخاطئة التي بوتkinetochores ح شقيقة نعلق على نفس القطب المغزل. وفشل لاحق من هذا الدواء يسمح لرؤية عملية تصحيح الخطأ. ويمكن أن يتم فحص تصحيح الخطأ في وجود مثبطات جزيء صغير أو knockdowns لدراسة مساهمة البروتينات مرشح لتصحيح الخاطئة إرفاق ملفات KT-MT. القدرة على تصور تصحيح الخطأ في الخلايا الحية هي أداة قوية لمزيد من فهم الآلية الجزيئية تشارك في هذه العملية المعقدة. ومع ذلك، فإن عددا كبيرا من الكروموسومات الموجودة في معظم خطوط الخلايا يشكل تحديا في مراقبة الفردية إرفاق ملفات KT-MT. فإن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يكون مثاليا لتطبيق فحص تصحيح الخطأ لأنها تحتوي على عدد قليل من 4 الكروموزومات 6، ولكن مثبطات جزيء صغير من كينيسين 5 مثل S-trityl-L-السيستين (STLC) وmonastrol 7-9 لا تؤثر التجمع المغزل أو كينيسين-5 وظيفة الحركة في خلايا ذبابة الفاكهة. وبالتالي فإننا أجناستيد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن كينيسين-5 البشري تحت المروج محرض التي تعتبر حساسة لكينيسين-5 مثبطات. يصف هذا البروتوكول كيفية ضربة قاضية للالذاتية ذبابة الفاكهة كينيسين-5 نديد، Klp61F، واستخدام هذا الخط خلية في خلية القاعدة تصحيح الخطأ الفحص.

<table><tbody><tr><td>كاشف تعداء الفعالية</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>ذبابة الفاكهة مركز الموارد الجينومية</td><td>13690</td><td>اسم الجين LD15641</td></tr><tr><td>شنايدر s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني ، معتمد</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>معطل بالحرارة ،</td></tr><tr><td>كبريتات النحاس (II) من أصل أمريكي (CuSO4)</td> <td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500 & nbsp ؛ مخزون mM</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp; مخزون mM في DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp; مخزون ملغ / مل في 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق</td> واسع <td>Promega</td><td>P1320</td><td>يبلغ تركيز dsRNA التقريبي من كل تفاعل حوالي 5-15 &nbsp ؛ ومايكرو. ز /& مايكرو ؛ ل</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F التمهيدي</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R التمهيدي</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR طقم تنظيف</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&nbsp; محلول ملغ / مل مصنوع عن طريق الذوبان في 1x PBS.</td></tr><tr><td>مصل الحمار المسلوق</td><td>مختبرات Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>محلول مخزون 5٪ في 1x PHEM buffer ، اجلب المحلول حتى يغلي. مخزنة في 4 &nbsp ؛ درجة مئوية.</td></tr><tr><td>تصاعد وسائل الإعلام</td><td></td><td></td><td>20 &nbsp; mM تريس الرقم الهيدروجيني 8.0,&nbsp; 0.5٪ N - بروبيل غالات ، 90٪ جلسرين. مخزنة في 4 &nbsp ؛ درجة مئوية.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 ملي مولار الأنابيب الرقم الهيدروجيني 6.9; 1&nbsp; ملي إجتا. 1 ملي مولار MgCl2</td></tr> <tr><td>مصدر الضوء الأبيض</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP مرشح مكعب</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed تصفية مكعب</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة NDC80 &nbsp;</td><td></td><td></td><td>مخصص من قبل Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1 & alpha ؛ (مضاد لألفا توبولين)</td><td>سيجما</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة المضادة للإصابة بعدوى الجنون</td><td>المضادة AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

توليد &quot;أنسنة&quot;<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; s2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores هي هياكل كبيرة قائمة على البروتين تتجمع على السنتروميرات أثناء انقسام الخلية وتربط الكروموسومات بالأنابيب الدقيقة المغزل. يتطلب التوزيع الصحيح للمادة الوراثية أن تصبح الحركية الشقيقة على كل كروموسوم ثنائية الاتجاه عن طريق الارتباط بالأنابيب الدقيقة من أقطاب المغزل المتقابلة قبل التقدم إلى الطور. ومع ذلك ، فإن حالات التعلق الخاطئة وغير ثنائية الاتجاه شائعة وتوجد مسارات خلوية لاكتشاف وتصحيح مثل هذه المرفقات أثناء انقسام الخلية. يشار إلى العملية التي يتم من خلالها زعزعة استقرار التفاعلات الحركية والأنابيب الدقيقة غير الصحيحة باسم تصحيح الخطأ. لدراسة تصحيح الخطأ في الخلايا الحية ، يتم إنشاء المرفقات غير الصحيحة عن قصد عن طريق التثبيط الكيميائي لمحرك كينيسين -5 ، مما يؤدي إلى تجميع المغزل أحادي القطب ، ويلاحظ الانتقال من سوء الاتجاه إلى ثنائي الاتجاه بعد غسل المخدرات. يشكل العدد الكبير من الكروموسومات في العديد من أنواع خلايا زراعة الأنسجة النموذجية تحديا في مراقبة أحداث تصحيح الخطأ الفردية. ذبابة الفاكهة تعتبر خلايا S2 موضوعات أفضل لمثل هذه الدراسات لأنها تمتلك ما لا يقل عن 4 أزواج من الكروموسومات. ومع ذلك ، فإن مثبطات كينيسين 5 الجزيئية الصغيرة غير فعالة ضد ذبابة الفاكهة كينيسين -5 (Klp61F). نصف هنا كيفية بناء خط خلية ذبابة الفاكهة الذي يستبدل بشكل فعال Klp61F بكينيسين 5 البشري ، مما يجعل الخلايا حساسة للتثبيط الدوائي للمحرك ومناسبة للاستخدام في مقايسة تصحيح الخطأ القائم على الخلية.

مطلوب Klp61F لتشكيل مغزل القطبين. كينيسين-5 البشري، Eg5، يمكن إنقاذ وظيفة Klp61F في خلايا ذبابة الفاكهة S2 (الشكل 1A و D). على إضافة المانع كينيسين-5 (STLC)، ومستويات المرتبط أنيبيب من الانخفاض محرك (1B الشكل وE)، وانهيارات المغزل، مما أدى إلى احتكار (الشكل 1C وF) في الخلايا التي تفتقر الذاتية Klp61F على رني الناجح (فيلم التكميلي 1). ومن الجدير بالذكر أن مغزل القطبين تنهار على إضافة STLC في الخلايا S2 أنسنة لكينيسين-5 النشاط غير مطلوب للحفاظ على الثنائية القطبية المغزل في الخلايا البشرية. قد يكون هذا التناقض المثير للاهتمام نتيجة للاختلافات في تداخل بين القطبين أنيبيب و / أو الاستقرار في النظم نموذج اثنين 14. كينيسين-5 تثبيط (الشكل 2A وE) يمكن ريف<html> rsed عن طريق الغسيل من المخدرات والتعافي من المغزل القطبين يمكن اتباعها مع مرور الوقت. على إزالة المانع (الشكل 2B وF)، وإعادة الزميلة-Eg5-mCherry مع ميكروتثبول بمثابة تجميع المغزل القطبين (الشكل 2C وG)، وخلايا يمكن أن تتطور إلى طور الصعود ثنائي القطب (الشكل 2D و H، فيلم التكميلي 2 ). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> الشكل 1. إضافة 1 ميكرومتر STLC يؤدي إلى مغزل أحادي في خلايا ذبابة الفاكهة S2. صور الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry (AC) وGFP-α تويولين (DF) خلال إضافة 1 ميكرومتر STLC. وأضاف Eg5 المانع في 3 دقائق. مقياس شريط = 5 ميكرون. الطابع الزمني = دقيقة: ثانية.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> الشكل 2. الإصلاحات المغزل بين القطبين على إزالة STLC. صور الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من خلية ذبابة الفاكهة 2 معربا عن Eg5-mCherry (AD) وGFP-α تويولين (EH) خلال تجربة STLC فشل. وجرفت STLC بها في 5 دقائق. A الإصلاحات المغزل القطبين في حدود 1 ساعة من إزالة STLC. مقياس شريط = 5 ميكرون. الطابع الزمني: الحد الأدنى: ثانية <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="فيلم 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الفيلم التكميلي 1. (انقر بزر الماوس للتحميل). Widefield التصوير مضان من مثال ممثل خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry ( اليسار) وGFP-α تويولين (يمين). وأضيف 1 ميكرومتر STLC في 2 دقيقة، وأشكال المغزل احتكار في غضون 10 دقيقة بعد إضافة المانع. تم الحصول على الصور كل 1 دقيقة ولعب بمعدل 10 لقطة في الثانية مقياس بار = 5 ميكرون. <img alt="فيلم 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">الفيلم التكميلي 2. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> التصوير Widefield مضان مثالا نموذجيا للخلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry (يسار) وGFP-α تويولين (يمين). تمت إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 1 ميكرومتر STLC وتشطف في 5 دقائق. A الإصلاحات المغزل القطبين في حدود 1 ساعة لإزالة المانع. تم الحصول على الصور كل 1 دقيقة ولعب بمعدل 10 لقطة في الثانية. مقياس شريط = 5 ميكرون.

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء خط خلية ذبابة الفاكهة S2 حساس لمثبطات الجزيئات الصغيرة ل kinesin-5. كما تم توضيح استخدام هذه الخلايا في مقايسة تصحيح الأخطاء المستندة إلى الخلية.

توليد &quot;أنسنة&quot;<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

الهدف العام من هذه التجربة هو استنباط خط خلوي من خلايا Drosophila S2 يكون حساساً لمثبطات الجزيئات الصغيرة لمحرك Kinesin-5، وذلك ليتم استخدامها في دراسة عملية تصحيح الخطأ. إن تصحيح الخطأ أثناء انقسام الخلية هو عملية يتم فيها زعزعة استقرار التفاعلات الخاطئة بين الحيز الحركي (kinetochore) والأنيبيبات الدقيقة، لمنح الخلية فرصة ثانية، أو فرصة أخرى، لتكوين ارتباطات صحيحة بحيث يمكن فصل الجينوم بشكل سليم. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الخلية تتعلق بعملية تصحيح الخطأ.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدام خط خلايا Drosophila S2 الذي يحتوي على عدد أقل من الكروموسومات، ويكون حساساً لمثبط Kinesin-5، وكلا الأمرين يسهلان رؤية أحداث تصحيح الخطأ الفردية. ابدأ بـ قارورة مربعة سعة 25 سنتيمتر تم استزراعها مسبقاً بخلايا S2 التي تعبر عن GFP-Alpha Tubulin وتصل درجة تلاحمها إلى 100%، ثم انقل اثنين ملليليتر من المزرعة إلى طبق قطر 35 مليمتر. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريباً حتى تلتصق جزئياً.أزل الوسط من الطبق، وأضف 1 mL من وسط Schneider، المكمل بـ FBS، إلى 2 µg من بنية Eg5-mCherry وكاشف عفن الخلايا (transfection reagent) لنقل الجينات إلى الخلايا وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم Parafilm لإغلاق الطبق بإحكام، ثم حضن الخلايا عند 25 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 18 ساعة. بعد ذلك، أضف 1 mL من وسط Schneider وأعد الخلايا إلى الحاضنة.في اليوم الثالث بعد عملية عفن الخلايا، انقل 500 µL من الخلايا التي تم عفنها إلى طبق زراعة أنسجة جديد بقطر 35 mm يحتوي على 1.5 mL من وسط Schneider's لإجراء تحريض اختباري. ولتحريض تعبير Eg5-mCherry، أضف كبريتات النحاس ليصل التركيز النهائي إلى 500 µM. أغلق الطبق بإحكام باستخدام Parafilm واحضنه عند 25 °C طوال الليل.ضع غطاء شريحة مطلي بـ Concanavalin A بمقاس 22 مليمتر في 22 مليمتر، تم تحضيره مسبقاً، في طبق زراعة أنسجة نظيف بمقاس 35 مليمتر. بعد ذلك، قم باستزراع 500 µL من الخلايا المستحثة ذات الالتحام الكامل (100% confluent) فوق غطاء الشريحة، واترك الخلايا تلتصق في درجة حرارة الغرفة. وللتحقق من تعبير Eg5-mCherry، قم بتركيب غطاء الشريحة في غرفة روز (rose chamber) مع الوسط الزراعي، ثم التقط صوراً في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجهر فلوري، وفقاً للإرشادات الواردة في البروتوكول النصي.بعد التأكد من أن الخلايا تعبر عن كل من Eg5-mCherry و GFP alpha tubulin، انقل ما تبقى من الخلايا المنقولة إليها الجينات وغير المحفزة إلى قارورة زراعة أنسجة مربعة بحجم 25 سنتيمتر، تحتوي على أربعة ملليلتر من وسط Schneider's. أضف Blasticidin S HCL بتركيز نهائي قدره 25 micrograms per milliliter إلى القارورة، واستمر في تقسيم الخلايا في وجود Blasticidin S HCL حتى يتوقف موت الخلايا. بعد تحضير الحمض النووي الريبي ثنائي السلسلة KLP61F وفقاً للبروتوكول المكتوب، ازرع خلايا S2 التي تعبر عن Eg5-mCherry في طبق زراعة بقطر 35 مليمتر وبدرجة تلاقي 25%، واتركها لتلتصق لمدة ساعة واحدة.قم بإزالة الوسط من الأطباق وأضف 1 mL من وسط Schneider الخالي من المصل إلى 5 µg من RNA KLP61F مزدوج السلسلة. بعد التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أضف 1 mL من وسط Schneider المحتوي على 10% FBS. قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة 25 °C.بعد 24 ساعة من المعالجة بـ dsRNA، يتم تحفيز التعبير عن Eg5-mCherry عن طريق إضافة كبريتات النحاس بتركيز نهائي قدره 500 micromolar. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 25 degrees Celsius لمدة 24 ساعة إضافية. ولإجراء التصوير الحي للخلايا، توضع شريحة غطاء مطلية بـ Concanavalin A بمقاس 22 millimeter by 22 millimeter في طبق زراعة أنسجة نظيف بمقاس 35 millimeter.قم بزراعة 500 microliters من الخلايا المعالجة بـ dsRNA والتي تم تحفيزها طوال الليل على غطاء الشريحة، واتركها تلتصق لمدة ساعة تقريباً. بعد جمع صور الفاصل الزمني للمغازل ثنائية القطب وفقاً للبروتوكول النصي، قم بإزالة الوسط من غرفة روز وإضافة وسط Schneider الذي يحتوي على one micromolar من STLC، واستبدل وسط STLC مرتين إضافيتين، مع التخلص من الوسط بعد كل غسلة لتصور انهيار المغزل. لغسل العقار وعكس انهيار المغزل، قم بإزالة الوسط المحتوي على STLC بعناية من غرفة روز وتخلص منه في حاوية النفايات، واستخدم ما مجموعه 6 to 8 millimeters من وسط Schneider لغسل الخلايا أربع مرات، مع التخلص من الأوساط بعد كل غسلة.ثم بعد إضافة وسط غذائي جديد لملء الحجرة، استمر في التصوير. وللوصول إلى الوسط الغذائي لغسل الدواء أو إزالته، قم بإزالة غطاء الشريحة العلوي بعناية من حجرة rose بينما تكون مثبتة على المجهر. وبديلًا عن ذلك، يمكن استخدام طبق بتري ذي قاعدة زجاجية معالج بـ Concanavalin A بطريقة مشابهة لشرائح الغطاء من أجل تصوير الخلايا الحية.بعد استزراع 500 µL من خلايا S2 المعالجة بـ KLP61F dsRNA على شريحة غطاء مطلية بـ Concanavalin A وترك الخلايا تلتصق، أضف 1.5 mL من وسط Schneider لجعل الحجم النهائي 2 mL. وبمجرد توقف الخلايا في طور الانقسام الفتيلي وفقاً للبروتوكول المكتوب، أضف 1 µM من STLC وحضنها لمدة ساعة واحدة للسماح بتكوين الأقطاب الأحادية. اغسل STLC باستخدام 2 mL من وسط Schneider الطازج لشطف شرائح الغطاء ثلاث مرات.لتثبيت الخلايا في نقاط زمنية مختلفة من تكوين المغزل ثنائي القطب، ولتقييم مواقع ارتباط الحيز الحركي، ابدأ باستخدام 2 mL من 1X BRB80 لشطف شرائح التغطية بسرعة. وفي غطاء كيميائي، أضف 2 mL من 10%PFA في 1X BRB80، واتركها للحضن لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، لنفاذ الخلايا، أضف 1%Triton X في 1X PBS واتركها للحضن لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، استخدم 2 mL من Triton X بنسبة 0.1% في PBS بتركيز 1X لغسل الخلايا ثلاث مرات. بعد ذلك، انقل غطاء الشريحة، بحيث تكون جهة الخلايا متجهة للأعلى، إلى قطعة من Parafilm داخل طبق Petri بقطر 150 mm. أضف 150 µL من مصل الحمير المغلي، أو BDS، إلى أغطية الشرائح، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة.بعد انتهاء فترة الحضن، أخرج القالب وأضف 150 µL من الأجسام المضادة الأولية التي تم تحضيرها وفقاً للبروتوكول النصي، ثم قم بالحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد غسل شرائح التغطية ثلاث مرات، أضف الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ Fluoro-4 والمخففة في محلول BDS، ثم قم بالحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. وبمجرد غسل شرائح التغطية ثلاث مرات، قم بحضنها مع 150 µL من محلول BDS الذي يحتوي على 1 µg/mL من DAPI لمدة خمس دقائق.بعد غسل شرائح التغطية مرتين، استخدم ثمانية 8 µL من وسط التثبيت لتثبيت العينة، بحيث يكون جانب الخلايا لأسفل، على شريحة بمقاس 3 × 1 بوصة. استخدم طلاء الأظافر لطلاء الزوايا. وأخيراً، استخدم عدسة شيئية بقوة 100X لتصوير الخلايا ذات المغازل ثنائية القطب التي تعبر عن Eg5-mCherry.قم بالتقاط سلسلة Z، تتكون من 30 مستوى بفواصل زمنية قدرها 0.2 micrometer في جميع القنوات. قم بتحليل الحيز الحركي (kinetochore) والأنيبيبات الدقيقة بعناية لتحديد حالة الارتباط. يُعد KLP61F ضرورياً لتكوين المغازل ثنائية القطب في خلايا Drosophila S2؛ ومع ذلك، فإن مثبطات Kinesin-5 ذات الجزيئات الصغيرة غير فعالة ضده.توضح هذه الصور أن بروتين Kinesin-5 Eg5 البشري يمكنه استعادة وظيفة KLP61F في خلايا Drosophila S2. عند إضافة مثبط Kinesin-5، وهو STLC، تنخفض مستويات المحرك المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة، وينهار المغزل، مما يؤدي إلى تكوين قطب واحد في الخلايا التي تفتقر إلى KLP61F الداخلي نتيجة لنجاح عملية RNA I. يوضح هذا الشكل أن تثبيط Kinesin-5 يمكن عكسه عن طريق غسل الدواء، ويمكن تتبع استعادة المغزل ثنائي القطب بمرور الوقت. عند إزالة المثبط، يعيد Eg5-mCherry الارتباط بالأنيبيبات الدقيقة، ويمكن للخلايا أن تتقدم إلى طور انفصال كروموسومي ثنائي القطب.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استنبات خط خلوي من خلايا Drosophila S2 يكون حساساً لمثبط جزيئي صغير لبروتين Kinesin-5. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ست ساعات تقريباً، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التخطيط المسبق، لأن هذه الطريقة تتطلب تحضيرات قبل عدة أيام.لا تنسَ أن العمل مع مثبطات الجزيئات الصغيرة قد يكون خطيراً، لذا يجب ارتداء القفازات دائماً. يمكن إثبات بناء خلايا ذبابة فاكهة مُبشرنة من خلال تطبيق تقنيات Crispr-Cas 9، واستبدال Drosophila Kinesin-5 بنظيره البشري. ومن شأن تطوير خلايا Drosophila مُبشرنة أن يعزز فهمنا لتصحيح الأخطاء والعمليات الخلوية الأساسية الأخرى في المستقبل.

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ذبابة الفاكهة شنايدر (S2) الخلايا نظام شعبية متزايدة لاكتشاف وتحليل وظيفي من الجينات. هدفنا هو وصف بعض التقنيات التي تجعل الخلايا المجهرية S2 مثل هذا النظام أهمية متزايدة التجريبية.

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل...

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

عند تلطيخ ذبابة الفاكهة الأقراص الخيالية ، غالبا ما يتم إجراء تشريح تقريبي حيث تتعرض الأقراص ولكنها تظل متصلة بالجسم. بمجرد تلطيخها ، يتم عزل الأقراص ذات الأهمية وتركيبها. يوضح بروتوكول المثال إجراء لتشريح القرص التخيلي للجناح وتركيبه.

ذبابة الفاكهة تشريح القرص الخيالي لليرقة: طريقة لمراقبة الظهارة النامية

يصف هذا البروتوكول تشريح وزراعة الخصيتين السليمتين والخراجات الجرثومية من ذبابة الفاكهة خادمة الشرانق. تسمح هذه الطريقة بالملاحظة المجهرية لتكوين المنوية خارج الجسم الحي. علاوة على ذلك ، نصف الفحص الدوائي لتأثير المثبطات على مراحل محددة من تطور الخلايا الجرثومية في الخصيتين العذراء.

فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

تحليل استنساخ الفسيفساء في ذبابة الفاكهة تخيلي القرص ظهارة هو نظام نموذج قوي لدراسة الآليات الوراثية والخلوية من تكون الأورام. نحن هنا وصف بروتوكول للحث على الأورام في أقراص ذبابة الجناح ذبابة الفاكهة باستخدام نظام GAL4-واس، وإدخال طريقة التشخيص لتصنيف المظاهر الورمية.

الاستقراء والتشخيص للأورام في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; إيماجينال القرص إبيثيليا

نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.

استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد تصميم وأداء التجارب في الجسم الحي في دروسوفيلا melanogaster لتقييم العواقب الوظيفية للمتغيرات الجينية النادرة المرتبطة بالأمراض البشرية.

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

نقدم بروتوكول باستخدام نهج وراثي إلى الأمام لفحص المتحولين الذين يظهرون التنكب العصبي في دروسوفيلا melanogaster. وهو يتضمن اختبار التسلق، وتحليل الأنسجة، ورسم خرائط الجينات وتسلسل الحمض النووي لتحديد الجينات الجديدة المتعلقة بعملية الحماية العصبية في نهاية المطاف.

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila

تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

تعلم كيفية توليد خط خلايا S2 من ذبابة الفاكهة حساس لمثبطات جزيئية صغيرة لكينيسين-5 باستخدام البناء Eg5-mCherry. تُسهّل هذه الطريقة دراسة تصحيح الأخطاء أثناء انقسام الخلايا.

توليد "أنسنة"

استكشف المزيد من الفيديوهات