تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange
فبراير 5, 2016
لقد أنشأنا نظام PSmOrange القابل للتحويل الضوئي كأداة قوية ومباشرة وغير مكلفة من حيث التكلفة لتتبع الخلايا في الجسم الحي في الخلفيات المعدلة وراثيا GFP. يصف هذا البروتوكول تطبيقه في نظام نموذج الزرد.
الهدف العام لتقنية تحويل الصور PSmOrange هو تتبع الخلايا في الحي أثناء التطور الجنيني والمرض. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي مثل الكشف عن أصل الخلايا التي تتطور إلى أنسجة وأعضاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها في الخلفيات المعدلة وراثيا GFP.
يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة في مجالات مختلفة من التحقيق مثل التجديد وتطور الورم والغزو. بعد إنشاء وتضمين الأجنة التي تعبر عن الأجنة PSMOrange و GFP وفقا لبروتوكول النص ، ضع الجنين تحت المجهر متحد البؤر واستخدم هدف الهواء 20x و 488 و 561 نانومتر ليزر لمسح العينة لتحديد منطقة لتحويل ضوئي. للكشف عن بروتين PSmOrange قبل التحويل الضوئي ، استخدم ليزر 561 نانومتر بقوة 0.74 مللي واط مقاسة عند مستوى التركيز فوق الهدف واضبط طاقة الليزر حسب الضرورة.
اضبط عوامل التكبير / التصغير لتسليط الضوء على مجال الاهتمام وتقليل وقت الحصول على الصورة وسمية الصورة. باستخدام ليزر 488 و 561 نانومتر في الوضع المتسلسل وخطوة Z بين 1.0 و 2.0 ميكرومتر ، احصل على مكدس Z يغطي الهياكل ذات الأهمية. اضبط متوسط الخط وتردد المسح الضوئي لتحسين جودة الصورة.
ثم امسح العينة ضوئيا وحدد منطقة الاهتمام ، أو أداة عائد الاستثمار ، لتمييز المنطقة المراد تحويلها إلى الصور قبل تثبيت عائد الاستثمار كمنطقة تحفيز. حدد وحدة التبييض الضوئية ، وحدد المربع لتنشيط الليزر 488 نانومتر ، ثم اضبط ليزر 488 نانومتر على 80٪ وسرعة المسح الضوئي على 0.5 ثانية لكل إطار. بعد ذلك ، افتح أداة تحويل الصور وانقر فوق إضافة"لتحديد بروتوكول تحويل الصور.
في قائمة تحفيز الاكتساب ، قم بتعيين المرحلة الأولى على الاكتساب وفي قائمة الحلقات ، حدد عدد الصور التي سيتم الحصول عليها قبل تحويل الصور. اضبط المرحلة الثانية على التحفيز وأدخل عدد أحداث التحفيز التي سيتم إجراؤها. اضبط المرحلة الثالثة كما هو موضح للمرحلة الأولى.
اختياريا، أدخل مرحلة الانتظار بعد المرحلة الثانية عن طريق إدخال الوقت للانتظار قبل الجولة الأخيرة من الحصول على الصورة. بمجرد تعيين المعلمات ، قم بتطبيق إعداد التحفيز وقم بتشغيل تحويل الصور. تعد الإعدادات الجزرية ضرورية لتحويل الصور في PSmOrange.
لضمان تحويل ضوئي ناجح ، يتم تصوير الجنين مباشرة بعد التجربة للكشف عن بروتين PSmOrange المحول ضوئيا. إذا لم ينجح التحويل ، يتم تكرار الإجراء. باستخدام ليزر 488 و 561 و 640 نانومتر ، وضبط الليزر 640 نانومتر على طاقة عالية ، تصل إلى 4.5 مللي واط ، احصل على مكدس z نهائي مع الإعدادات الموضحة للتو.
لفك الجنين ، قم بإزالة الغرفة من المجهر واستخدم الملقط لإزالة الجنين من الاغاروز. انقل الجنين إلى طبق بتري بلاستيكي جديد معقم ، أو صفيحة معقمة من 6 آبار ، تحتوي على 0.2 مللي مولار PTU في E3. احتضان الجنين عند 28 درجة مئوية حتى المرحلة المطلوبة من التطور. لتحليل مصير خلايا PSmOrange المحول ضوئيا ، أعد تضمين الجنين وفقا لبروتوكول النص.
تحت المنظار متحد البؤر ، امسح العينة ضوئيا لتحديد الخلايا المحولة ضوئيا في الهيكل المعدل وراثيا GFP المعني. استخدم ليزر 488 و 561 و 640 نانومتر للحصول على مكدس z مع كومة ثابتة من 1 إلى 2 ميكرومتر في الوضع المتسلسل الذي يغطي الهياكل. باستخدام برنامج Image J Fiji ، حدد الخلايا التي تشارك في التعبير عن GFP والبروتين المحول ضوئيا.
قم بتكرار المكدس الأصلي ، واستخدم المكون الإضافي Gaussian Blur وحاسبة الصور لطرح الأكوام الملساء من الأصل. قم بتطبيق عتبات محددة على القنوات الخضراء والحمراء البعيدة من أجل تسليط الضوء على الخلايا المحولة ضوئيا. ثم استخدم أداة تحليل الجسيمات لاكتشاف مناطق العتبة في القناة الخضراء بإعداد مناسب.
كرر هذه الخطوة للقناة الحمراء البعيدة. افتح المكون الإضافي لحاسبة الصور لاكتشاف الخلايا ذات التوطين المشترك. اعرض باللون الأصفر عائد الاستثمار المتداخل في القناة الخضراء أو الحمراء البعيدة باستخدام أداة تحليل الجسيمات.
باستخدام برنامج NIS-Elements ، قم بإجراء تقييم تاريخ ثلاثي الأبعاد وعرض المكدس في 3D باستخدام خيار إظهار عرض الحجم. ثم استخدم واجهة الرسومات لتحديد القنوات الخضراء والحمراء والحمراء البعيدة ، وضبط السطوع والتباين واقتصاص المكدس ثلاثي الأبعاد لتسليط الضوء على المنطقة المحولة ضوئيا. يظهر هنا مثال على نظام التحويل الضوئي PSmOrange في أجنة GFP ذات الرأس العائم FOXD3 المعدلة وراثيا لأسماك الحمار الوحشي.
في 26 ساعة بعد الإخصاب ، تم تحويل مجموعتين من الخلايا في الجزء الأمامي من الصنوبر وتصويرهما على الفور. تم اكتشاف البروتين باستخدام ليزر أحمر بعيد 640 نانومتر ولكن ليس بليزر 561 نانومتر. في هذه الخلايا ، تم تقليل تعبير GFP في البداية بسبب التبييض الضوئي.
في 52 HPF ، تم اكتشاف GFP و H2B PSmOrange في الخلايا التي تعبر عن بروتين H2B PSmOrange المحول ضوئيا. شكل عدد قليل من هذه الخلايا الحجري على الجانب الأيسر من الدماغ. تتوافق هذه النتيجة مع التقارير السابقة حول أصل الخلية المجاورة في الصنوبر الأمامي وتظهر قابلية تطبيق تقنية PSmOrange في جنين الفقاريات المعدلة وراثيا GFP الحي.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل تتبع الخلايا في الأجنة التي تم التلاعب بها وراثيا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتسلسلات الهرمية الجزيئية الكامنة وراء تطور الخلية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يُعد نظام PSmOrange أداة فعالة من حيث التكلفة لتتبع الخلايا داخل الجسم الحي في الخلفيات المعدلة وراثياً ببروتين GFP، خاصة في نماذج سمك الزيبرا. يسهل هذا البروتوكول دراسة أصول الخلايا أثناء التطور الجنيني والمرض.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء النمائي
- تتبع الخلايا
- النمو الجنيني
خلفية علمية
- تتيح تقنية التحويل الضوئي PSmOrange تتبع الخلايا في الكائنات الحية.
- تُطبق هذه الطريقة في مجالات بحثية متنوعة، بما في ذلك التجديد وتطور الأورام.
- يمكن استخدامها في الخلفيات الوراثية المعدلة بـ GFP، مما يعزز من تعدد استخداماتها.
- يُستخدم المجهر البؤري (Confocal microscopy) للتصوير والتحويل الضوئي للخلايا.
الغرض من الدراسة
- لتتبع الخلايا أثناء التطور الجنيني وعمليات المرض.
- للكشف عن أصول الخلايا التي تتطور إلى أنسجة وأعضاء.
- لتوفير رؤى حول السلوكات الخلوية في سياقات بيولوجية متنوعة.
الطرق المستخدمة
- توليد أجنة تعبر عن PSmOrange وGFP.
- طمر الأجنة لتحليلها بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy).
- استخدام ليزرات بطول موجي 488 و561 nm للتصوير.
- التحويل الضوئي لبروتين PSmOrange لأغراض التتبع.
النتائج الرئيسية
- تتبع الخلايا بنجاح في نماذج zebrafish باستخدام نظام PSmOrange.
- إثبات القدرة على تصور أصول الخلايا وسلوكياتها.
- تسليط الضوء على قابلية تطبيق هذه الطريقة في مختلف مجالات البحوث البيولوجية.
- توفير بروتوكول مباشر لاتباعه من قبل الباحثين.
الاستنتاجات
- يُعد نظام PSmOrange أداة فعالة لتتبع الخلايا داخل الجسم الحي.
- ويوفر هذا النظام مزايا كبيرة في دراسة علم الأحياء النمائي.
- ويمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهم العمليات البيولوجية المعقدة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يتيح نظام بروتين PSmOrange القابل للتحول الضوئي تتبعاً دقيقاً للخلايا داخل الجسم الحي في أجنة أسماك الزيبراتش المعدلة وراثياً ببروتين GFP، مما يعالج قيداً رئيسياً في أبحاث البيولوجيا التنموية حيث تفتقر السلالات المعدلة وراثياً الحالية إلى مراسلين متوافقين لتتبع السلالات الخلوية. وتدعم هذه القدرة عملية تقليل المخاطر الميكانيكية في التحقق من الأهداف من خلال السماح بالتصور المباشر للأصول الخلوية وقرارات المصير في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض، لا سيما في تطبيقات علم الأورام والطب التجديدي التي تشمل تطور الورم وغزوه وتجديد الأنسجة. وتعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال توفير بيانات كمية ومحددة مكانياً حول هجرة الخلايا وتمايزها داخل كائنات حية سليمة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تتبع مجموعات خلوية محددة في خلفيات معدلة وراثياً لتوضيح الأصول الخلوية للأنسجة والأعضاء.
- القيمة التشغيلية: متوافقة مع خطوط GFP المعدلة وراثياً الحالية، مما يلغي الحاجة إلى توليد محفزات جديدة ويقلل من وقت تطوير النماذج.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال المراقبة المباشرة لقرارات مصير الخلايا، مما يعزز الثقة في الارتباطات بين الآلية المرضية والهدف العلاجي.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يولّد بيانات مكانية وزمنية قابلة للقياس الكمي حول هجرة الخلايا التي تم تحويلها ضوئيًا، مما يتيح إجراء مقارنة موضوعية للاضطرابات الجينية أو الفارماكولوجية.
- القيمة التشغيلية: يستخدم المجهر البؤري الماسح (confocal microscopy) القياسي مع استثارة ليزرية تتابعية (488, 561, 640 nm)، ولا يتطلب أي معدات متخصصة تتجاوز تلك المتوفرة في مراكز التصوير النمطية.
- القابلية للتوسع: متوافق مع التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة وأدوات معالجة البيانات اللاحقة (ImageJ Fiji, NIS-Elements) لإجراء تحليل التوضع المشترك (co-localization) مع GFP بشكل قابل للتكرار.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: قابلة للتطبيق المباشر في دراسة نماذج غزو الخلايا الورمية والانتشار السرطاني في نماذج السرطان المزروعة غريباً أو النماذج المعدلة وراثياً في سمك الزيبرا.
- الاستمرارية الانتقالية: تتيح انتقالاً سلسلاً من مرحلة الاكتشاف (تتبع أصل الخلايا) إلى التحقق قبل السريري من خلال مراقبة الانغراس والهجرة والاندماج للخلايا المحولة ضوئياً داخل الجسم الحي.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: توفر نقاط نهاية بصرية وكمية لاتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف في مراحل التطوير قبل السريري المبكرة بناءً على السلوك الخلوي في سياقات ذات صلة بالمرض.
تكامل سير العمل والمسار التحليلي
يندرج نظام PSmOrange ضمن التسلسل الممتد من الاكتشاف المبكر إلى المرحلة ما قبل السريرية، حيث يعمل كأداة للفحص المظهري والتحقق الآلي، وهو ما يربط بين التعديل الجيني والقراءات الخلوية الوظيفية في نماذج الفقاريات الحية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين رسم خرائط مصير مجموعات خلوية محددة استجابةً للاضطرابات الجينية أو البيئية في أجنة GFP المعدلة وراثياً.
- الفحص: تولد مخرجات كمية معيارية وقابلة للتكرار (نسب التوضع المشترك، مسافات الهجرة) مناسبة لفحوصات المركبات أو الكابتات/المعززات الجينية.
- التحليلات: تنتج بيانات فلورية متعددة القنوات (GFP، وPSmOrange البرتقالي/الأحمر، وPSmOrange الأحمر البعيد المحول ضوئياً) مما يتيح تحليلاً دقيقاً للتوضع المشترك والجسيمات من أجل التنميط الظاهري الموضوعي.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالعمل قبل السريري من خلال تتبع سلوك الخلايا في نماذج التجدد والتقدم الورمي، مما يفيد في التحقق الآلي من صحة الأهداف.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تمثل قدرة منصة قابلة لإعادة الاستخدام؛ حيث يسمح حقن mRNA بالنشر السريع عبر سلالات معدلة وراثياً متعددة دون الحاجة إلى توليد سلالات مستقرة جديدة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف من خلال تقديم دليل بصري مباشر على الديناميكيات الخلوية في الكائنات الحية السليمة.
- القيمة التشغيلية: يتيح التوحيد القياسي عبر المختبرات من خلال بروتوكولات تحويل ضوئي محددة وإعدادات ليزر (488 nm بقدرة 80%، 0.5 sec/frame؛ و640 nm حتى 4.5 mW للكشف).
- القيمة الاستراتيجية: يحسن كفاءة رأس المال من خلال الاستفادة من موارد GFP المعدلة وراثياً الموجودة، مما يتجنب التحديد المكلف للمروجات من الصفر وتوليد السلالات.
- تأثير المحفظة: يدعم تحديد الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال تقديم بيانات وظيفية مبكرة في vivo حول سلوك الخلايا، مما يقلل من الفشل في المراحل المتأخرة بسبب التعقيد البيولوجي غير المتوقع.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر البؤري (confocal microscopy)، وتقنيات التحويل الضوئي (photoconversion)، وفصل الأطياف الفلورية (fluorescence spectral unmixing).
- يعتمد على توفر أنظمة المجهر البؤري بالمسح الليزري المزودة بليزرات ذات أطوال موجية 488 و 561 و 640 nm ومجموعات المرشحات المناسبة.
- يستلزم توحيد معايير اختيار منطقة الاهتمام (ROI)، وقوة الليزر، وسرعة المسح، ومعلمات مجموعة المقاطع العرضية (z-stack) بين المستخدمين لضمان تكرار النتائج.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع الأسماك العظمية الأخرى غير سمكة الزيبرا تحسين جرعة mRNA وكفاءة التحويل الضوئي.
- قيد عملي: تعتمد كفاءة التحويل الضوئي على مستويات تعبير البروتين ومدى وصول الليزر إلى الخلايا المستهدفة في الأنسجة الأكثر سمكاً.
