باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو مساعدة المستخدمين على إنشاء خط أنابيب عالي الإنتاجية لجمع ومعالجة التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التصوير التصويري الإلكتروني بالتبريد ، مثل: كيف يمكنني التعامل مع البيانات التي تم جمعها باستخدام أجهزة الكشف من الجيل الجديد ، ومعالجة كمية هائلة من البيانات التي تنتجها برنامج جمع سلسلة الإمالة الآلي؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمستخدم تكوين حزم برامج متعددة بطريقة موحدة ، لإيجاد خط أنابيب فعال للمعالجة الآلية لسلسلة الإمالة ، مما يسمح بقضاء المزيد من الوقت في تحليل التصوير المقطعي.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في cryo-ET لأن العديد من الخطوات الشاقة مطلوبة للتعامل مع البيانات الضخمة التي تم إنشاؤها من المجهر الإلكتروني. خطرت لنا فكرة هذا التطور لأول مرة قبل خمس سنوات عندما كان علينا أن نمر يدويا بمئات الخطوات للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لبكتيريا واحدة. مقدما ، استشر بروتوكول النص الخاص بإعداد خلايا الشيغيلا فليكسنيري الصغيرة.

بعد ذلك ، قم بإعداد شبكات الفحص المجهري الإلكتروني كما هو موضح في منشور JoVE الحالي والموثق أيضا في بروتوكول النص. بعد تحميل مرحلة EM بمجموعة من الخلايا الصغيرة المضمنة في الجليد المزجج ، ابدأ في جمع خرائط التكبير المنخفض لسلسلة الإمالة. أثناء عرض شاشة الفلورسنت بتكبير منخفض ، حوالي 2300x ، ابحث عن مربعات الشبكة المقبولة للصورة.

يجب أن يحتوي هذا الموقع على ثلج رقيق وموضوع الاهتمام بدون ملوثات. بعد ذلك ، اضبط العرض على منتصف مربع الشبكة ، وانقر فوق الزر "إضافة موضع المرحلة" لحفظ الموقع. بعد ذلك ، كرر العملية حتى يتم حفظ جميع مربعات الشبكة المقبولة لمواقعها.

تبدأ الخطوة التالية بفتح ملف مونتاج جديد. في مربع حوار الإعداد، قم بتعيين X و Y بحيث يتم التقاط مربع الشبكة بالكامل. بالنسبة لشبكة شبكية قياسية 200 ، قم بإنشاء مساحة 10 × 10 بقيمة Binning عالية ، مثل ثمانية.

قم أيضا بتبديل مرحلة الحركة بدلا من خيار تغيير الصورة وتخطي الارتباطات المستخدمة لمحاذاة القطع. الآن، في نافذة Navigator، حدد موضع المرحلة الأولى الذي سيتم الحصول عليه باستخدام مفتاح التبديل Acquire. استمر في القيام بذلك لكل موضع مرحلة.

بعد ذلك ، ضمن قائمة Navigator ، انقر فوق اكتساب في النقاط. في مربع الحوار الذي يفتح، قم بالتبديل للحصول على صورة الخريطة والمركزية التقريبية. قم بإلغاء تبديل جميع الخيارات الأخرى.

ثم انقر فوق متابعة ، وسيتم إجراء مونتاج لكل موضع مرحلة. استمر في العمل مع برنامج SerialEM. في Navigator ، حدد الخرائط المكتسبة ، وانقر فوق تحميل الخريطة.

ثم انقر فوق إضافة نقاط، وحدد النقاط على الخريطة حيث يجب الحصول على سلسلة الإمالة. بعد إجراء التحديدات، انقر فوق إيقاف إضافة النقاط وكرر العملية مع كل خريطة تم جمعها. بعد ذلك ، افتح المعلمات الموجودة ضمن الكاميرا القائمة ، واضبط أوضاع التركيز والتجربة والتسجيل.

قد يكون خيار تسجيل البيانات المجزأة بالجرعة ذا أهمية خاصة ، ويمكن تحديد ذلك ضمن خيارات السجل. للمتابعة، حدد إحدى النقاط في الخريطة المعروضة حاليا، وقم بتبديل خيار سلسلة الإمالة في نافذة Navigator. في مربع الحوار الذي يفتح، اختر معلمات سلسلة الإمالة.

بعد ذلك ، كرر عملية تبديل خيار سلسلة الإمالة لكل نقطة من النقاط المحددة في الخريطة. بعد ذلك ، من المتصفح ، ابدأ خيار الاستحواذ عند النقاط. ضمن مربع الحوار ، قم بتبديل المهام الأولية ، وإعادة المحاذاة إلى العنصر ، والتركيز البؤري التلقائي ، والمركزية التقريبية.

بعد ذلك، قم بتعيين المهمة الأساسية للحصول على سلسلة الإمالة، واختر إغلاق قيم الأعمدة في النهاية لإغلاق العمود عند تجميع جميع النقاط. عند تنفيذ العملية ، سيتم جمع سلسلة إمالة في كل نقطة يتم تبديلها لتجميع سلسلة الإمالة في كل خريطة. باستخدام سلسلة الإمالة الأصلية ، وسجل الإخراج من SerialEM ، والصور الفردية المجزأة بالجرعة كلها في دليل العمل الحالي ، في محطة طرفية ، قم بتنفيذ الأمر التالي لإزالة الأداة المتحركة التي يسببها الحزمة.

تابع محاذاة سلسلة الإمالة وإعادة بنائها. اكتب الأمر tomoauto في المحطة الطرفية على النحو التالي. إلى الأمر ، قم بإلحاق اسم ملف سلسلة الإمالة للمعالجة ، متبوعا بالقطر الائتماني بالنانومتر.

إذا لم تكن معالجة CTF مطلوبة، فما عليك سوى حذف الخيار من الأمر. هذا الأمر هو الاستخدام الرئيسي ل tomoauto ، مما يسمح للمستخدمين بتنفيذ جميع العمليات المتضمنة في محاذاة سلسلة الإمالة ، والتي تتطلب في الأصل تدخلا يدويا للمستخدم ، في أمر واحد ، مما يسمح للمستخدمين ببرمجة معالجة الدفعات بسرعة. الآن ، باستخدام الأمر 3dmod ، انظر إلى سلسلة الإمالة المحاذاة بحثا عن أي أخطاء صارخة.

هنا اسم الملف هو اسم سلسلة الإمالة بدون لاحقة. بعد ذلك، افحص CTF المقدر باستخدام الأمر الموضح هنا. مرة أخرى ، اسم الملف هو اسم سلسلة الإمالة بدون لاحقة.

أيضا ، في سجل الإخراج الذي تم إنتاجه بواسطة الأمر tomoauto ، تحقق من الخطأ المتبقي للمحاذاة. هذا مقياس كمي للجودة الشاملة للمحاذاة. إذا كانت المحاذاة مقبولة ، فتابع حساب إعادة البناء.

يتم تعيين هذا الأمر لتصحيح CTF ، ومسح العلامات الإيمانية المستخدمة في المحاذاة من سلسلة الإمالة. لتخطي الفحص البصري، والانتقال مباشرة إلى إعادة البناء، أستخدم هذا الأمر. يحتوي Tomoauto على العديد من الخيارات التي يمكن الوصول إليها.

أحدهما على وجه الخصوص هو القدرة على تضمين التكوينات المحلية الموصوفة بواسطة ملف إضافي ، وفقا لوثائق tomoauto. قم بتضمين اسم هذا الملف في مربع حوار سطر الأوامر باستخدام خيار التكوين المحلي قبل إلحاق اسم ملف سلسلة الإمالة. تعد القدرة على إنشاء ملفات التكوين المحلية أقوى ميزة في tomoauto ، مما يسمح للمستخدمين بتكوين كل أمر مستخدم بالكامل ، وضبط التنفيذ على مجموعات بيانات محددة أو صعبة مع الحفاظ على المعالجة الآلية.

يوجد داخل بروتوكول الاختبار إرشادات إضافية حول كيفية تنفيذ متوسط المخطط المقطعي الفرعي. باتباع البروتوكولات الموصوفة ، تم عمل سلسلتين من الإمالة المحاذاة باستخدام tomoauto. يتم حساب المحاذاة الدقيقة من نموذج يحدد بشكل مثالي إحداثيات العلامة الإيمانية

عند 50 درجة ، تتبعت سلسلة إمالة واحدة جزيئات الذهب بشكل صحيح ، مما يشير إلى محاذاة مقبولة. بينما ، في حالة سلسلة الإمالة الثانية ، انحرفت العديد من نقاط النموذج ، الموضحة باللون الأحمر ، عن علامة الذهب المقابلة لها ، مما يوضح أن النموذج لم ينتج محاذاة مناسبة. عندما يتم جمع سلسلة الإمالة ، يقوم tomoauto بمحاذاة 80 إلى 90٪ من سلسلة الإمالة المجمعة.

بعد إعادة البناء ، يكون التصوير المقطعي النهائي عبارة عن حجم ثلاثي الأبعاد لعينة الصورة. يمكن بعد ذلك استخدام هذا للتعليق الخلوي عن طريق التجزئة ، أو متوسط المقطعي الفرعي للحصول على معلومات عالية الدقة للآلية الجزيئية داخل العينة. يظهر متوسط التصوير المقطعي الفرعي البالغ 2.7 نانومتر من Shigella flexneri المرفق المودع في EMDB التحسن الكبير لهذه التقنية على عرض الحقن في مقطعي واحد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع ومعالجة بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد باستخدام SerialEM و tomoauto بطريقة آلية عالية الإنتاجية. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لجمع ما يقرب من 100 سلسلة إمالة في اليوم ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، ومحاذاة سلسلة الإمالة في 20 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما التحقق من جودة محاذاة سلسلة الإمالة.

إذا لم تتم محاذاة مجموعة من سلاسل الإمالة بشكل جيد، فحاول المحاذاة يدويا، ونقل المعلمات إلى تكوين محلي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل متوسط المقطعي الفرعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تحديد البنية عالية الدقة للمجمعات الجزيئية الكبيرة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال cryo-EM لاستكشاف الهياكل عالية الدقة في الموقع في البكتيريا والفيروسات والكائنات الحية الأخرى.