الطريقة ورم الكمي القائم على تلألؤ بيولوجي لتطور الورم الرصد وآثار العلاج في نماذج الماوس الغدد اللمفاوية

الهدف العام من إجراء التصوير هذا هو توحيد إجراءات الحصول على صور التألق الحيوي وتحليل الصور للحصول على بيانات كمية للمقارنة داخل التجارب المختلفة أو فيما بينها. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تصوير التألق الحيوي، مثل: كيف يمكن قياس بيانات التصوير بطريقة قابلة للتكرار؟ وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في سهولة إعدادها في أي مرفق حيواني يمتلك جهاز تصوير التألق الحيوي، وأنها لا تتطلب حسابات معقدة.

قم بتشغيل جهاز التصوير، وافتح برنامج الاستحواذ (Acquisition software). انقر فوق "Initialize" لتهيئة الكاميرا والمنصات والعدسات. بعد التأكد من مستوى التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرصة الساق، ضع الفأر على وسادة تدفئة وقم بوضع مرهم العين.

بعد ذلك، استخدم إبرة عيار 25 لحقن 100 µL من محلول ملح بوتاسيوم D-Luciferin المُحضّر حديثاً داخل التجويف الصفاقي. في هذه الحالة، تُعبر الخلايا الورمية عن إنزيم luciferase الخاص باليراعات. يقوم هذا البروتين بأكسدة D-Luciferin وإنتاج ضوء يمكن اكتشافه بواسطة جهاز التصوير.

بعد 10 دقائق، ضع الفأر في وضعية الانكفاء داخل جهاز التصوير بحيث يكون ظهره مواجهاً للكاميرا وبأكثر وضعية مسطحة ممكنة. اختر ميزة التعريض التلقائي وانقر على Acquire للحصول على صورة خلفية للحيوان. بعد ذلك، ضع الفأر في وضعية الاستلقاء على الظهر، مع مباعدة الأطراف الأمامية حتى لا تحجب منطقة الصدر.

تأكد من أن مربع اختيار التعريض التلقائي لا يزال محدداً، ثم التقط صورة أمامية للحيوان. بعد ذلك، أعد الفأر إلى وسادة التدفئة حتى يستعيد وعيه بالكامل، وعند هذه النقطة، يمكن إعادة الحيوان إلى قفصه. لقياس التألق الحيوي كمياً، انقر على "View" في القائمة واختر "Tool Palette" إذا لم تكن معروضة بالفعل.

بعد ذلك، انقر فوق علامة تبويب أداة منطقة الاهتمام (region of interest)، واختر زر الخط الكنتوري (contour)، ثم حدد الرسم الحر (Free Draw). وباستخدام أداة الرسم الحر، تتبع حواف الفأر بالكامل أو منطقة محددة في صورة العرض الأمامي لتحديد منطقة الاهتمام، مع النقر بزر الماوس الأيمن لإغلاق الخط الكنتوري. حدد Radiance من قائمة وحدات القياس (Units) المنسدلة في أعلى يسار الصورة إذا لم تكن محددة بالفعل.

بعد ذلك، اقرأ القيمة الموجودة في مربع "إجمالي تدفق الفوتونات في الثانية" لقياس التدفق الفوتوني. ثم، انقر على قائمة "عرض" (View) ومن ثم قياسات المنطقة ذات الاهتمام. بعد تكرار التحليل لصورة العرض الخلفي، قم بجمع قيم التدفق الفوتوني التي تم الحصول عليها لكلا العرضين للحصول على درجة السطوع (luminoscore).

في هذه التجربة، أمكن الكشف عن الورم بعد 10 دقائق فقط من الحقن. وتؤكد الصور وحدها وجود الخلايا الورمية في الموقع الصحيح. ومع ذلك، أظهر قياس كمية التألق الحيوي فرقاً واضحاً بين الحيوانات التي تلقت الحقن وتلك التي لم تتلقها.

ومن المثير للاهتمام أن الإشارة التي تم الحصول عليها في النموذج تحت الجلدي كانت أعلى بـ 100 مرة منها في نموذج سرطان اللمفوما داخل العين الأولي، وهو ما يتفق مع عدد الخلايا المحقونة. وهنا، تظهر صور ممثلة لنمو الورم في فئران مصابة بسرطان اللمفوما داخل العين الأولي في مجموعة التحكم والمجموعة المعالجة بـ CpG أنه بعد فترة كافية، بدأت النقائل في الظهور في مجموعة التحكم. وعلى الرغم من أن الورم الأولي لم يبدُ حساساً للعلاج، فقد لوحظ عدد أقل من النقائل في المجموعة المعالجة بـ CpG.

وبالفعل، يُظهر التحليل الكمي لعبء الورم في كل مجموعة أن CpG يبطئ تطور الورم، مما يؤدي إلى وجود فرق ذو دلالة إحصائية في تألق الورم بين المجموعات المعالجة ومجموعات الضبط بعد 28 يومًا. في هذا النموذج تحت الجلدي، تم زرع ورمين على كل جانب من جوانب الفأر، حيث تم إعطاء العلاج في الموقع (in situ) لجانب واحد في اليوم صفر، بينما عمل الورم في الجانب المقابل كعنصر ضبط له. بعد ذلك، تم رسم منطقتين من مناطق الاهتمام لكل فأر، وتم قياس النسبة بين درجة التألق (luminoscore) في الجانبين المعالج والضابط.

بعد مرور 13 يوماً من إعطاء العلاج، لوحظ انخفاض ملحوظ في نسبة luminoscore، مما كشف عن امتصاص الورم المعالج، وهو ما أثبتته صور bioluminescence المقابلة. وبمجرد البدء، يمكن إتمام هذا التحليل في غضون دقيقتين لكل حيوان إذا نُفذ بشكل صحيح. وعقب هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل التحديد النوعي لموقع الورم للإجابة على أسئلة إضافية حول آليات توطين الخلايا الورمية أو انتشارها.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين ومجال التصوير بالتلألؤ البيولوجي لاستكشاف تطور الورم في النماذج قبل السريرية للحيوانات الصغيرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير بالتلألؤ البيولوجي لقياس العبء الورمي بطريقة قابلة للتكرار. لا تنسَ أن العمل مع الحيوانات الصغيرة والأدوات الجراحية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، وأنه يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل التعقيم الصحيح للأدوات، عند تنفيذ هذا الإجراء.