عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوصيف البويضات التاجية للفأر بناء على تنظيم الكروماتين ، وفقا لقدرتها على الحفاظ بشكل كامل على التطور الجنيني المحتمل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي ، مثل كيفية التمييز بين نوعين مختلفين من البوية الباطنية وعزلهما ، SN ، النواة المحيطة ، و NSN ، النواة غير المحاطة ، المقيمة في الحيز الباطني لمبيض الثدييات. لحصاد المبايض ، ابدأ بحقن إناث الفئران البالغة من العمر ثلاثة إلى ستة أسابيع مع 2.5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل.

بعد يومين ، قبل حوالي ساعة من الحصاد ، املأ طبق بتري معقم بمتوسط M2 وأضف عدة قطرات 20 ميكروليلتر من M2 متوسط إلى طبق بتري ثان ، وقم بتغطية كل قطرة ب 1.5 مل من الزيت المعدني. ثم انقل جميع أطباق بتري إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح للوسط بالتوازن. بعد ذلك ، استخدم مقص تشريح معقم لعمل شق في الجلد الذي يغطي جدار البطن ، يليه شق في الصفاق للفأر الأول المحقون بالهرمونات.

استخدم ملاقط معقمة لتحريك الأمعاء جانبا لتحديد موقع أنابيب الرحم ، والتي تشكل شكل V بدءا من المثانة. بعد تحديد موقع المبايض أسفل الكلى ، أمسك أنبوب رحم واحد وحرر المبيض المقابل بشق صغير في أسفل الأنسجة. كرر العملية لحصاد المبيض الآخر ، ثم ضع كلا المبيضين في طبق بتري المملوء بوسط M2 متوازن مسبقا.

قبل عزل البويضة الباطنية، اصنع ماصات زجاجية عن طريق الإمساك بطرفي ماصة باستور الزجاجية وإمساك الماصة أفقيا فوق لهب موقد بنسن. عندما يبدأ الزجاج في الذوبان ، قم بإزالة الماصة من اللهب وافصل الجهاز بسرعة. باستخدام ظفر، قم بقص الزجاج الزائد بإحكام بالقرب من النقطة الضيقة للماصة لتقصير الطرف، ولتحقيق قطر شعري داخلي يبلغ حوالي 100 ميكرون.

من المهم أن يكون لديك قطر الماصة المناسب. إذا كانت ضيقة جدا ، فسوف تعلق البويضات وتتفتت وتموت. ثم قم بتوصيل الطرف غير المعدل للماصة بأنبوب شفاطة.

بعد ذلك ، انقل المبايض إلى طبق بتري الذي يحتوي على ملليلتر واحد من وسط M2 المتوازن مسبقا ، واستخدم إبرة حقنة الأنسولين المعقمة لثقب البصيلات التاجية للمبيضين برفق. عندما يتم إطلاق البويضات ، اجمعها برفق عن طريق ماصة الفم ، مع الحرص على عدم شفط أي خلايا بصيلات أو بقايا أنسجة أخرى. ثم قم بسحب كل بويضة بسرعة من خلال عدة قطرات متوسطة M2 متوازنة مسبقا لإزالة جميع الخلايا الركامية المرتبطة بالمنطقة الشفافة للبويضات.

بمجرد تجريد البويضات ، قم بتسوية البويضات بعناية في قاع القطرات الفردية من وسط M2 المتوازن الطازج. لتلطيخ البويضات ، استخدم ماصة الفم لنقل الخلايا إلى 20 قطرة ميكرولتر من Hoechst 33342 ، مخففة في وسط M2. ثم انقل البويضات إلى طبق بتري جديد يحتوي على خمس قطرات ميكرولتر من متوسط M2 مغطى بالزيت المعدني ، مع الحرص على تسوية البويضات بشكل فردي في قاع كل قطرة.

عندما يتم نقل جميع البويضات ، ضع الطبق تحت المجهر الفلوري وقم بإثارة الخلايا لفترة كافية لتصور وجود أو عدم وجود حلقة حول النواة. احرص على عدم الإفراط في تعريض البويضات ، حيث يمكن أن يتلف الكروماتين ويمكن أن تموت البويضات إذا تعرضت لفترة طويلة. بعد تحديد بويضات SN و NSN ، قم بفرز الخلايا في طبق بتري المقابل المناسب في الكاشف ذي الصلة لتحليل المصب المطلوب ، وفقا لتنظيم الكروماتين الخاص بهم.

المحتمل أن يكون تلطيخ Hoechst 33342 لتنظيم الكروماتين هو الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء. يجب أن تكون خمس إلى 10 ثوان من الإثارة طويلة بما يكفي لفرز البويضات بناء على وجود أو عدم وجود الكروماتين المحيط بنواة كل بويضة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أقل من ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم العمل في درجة حرارة الغرفة وتذكر علاج كل من المبايض والبويضات برفق. بعد هذا الإجراء ، يمكن بعد ذلك استخدام البويضات للنضج في المختبر والتخصيب في المختبر. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي للإجابة على سؤال لا يزال مفتوحا ، وكيفية التعرف على نوعين من البويضات التركية الموجودة في مبيض الثدييات والتمييز بينهما.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية صنع واستخدام ماصة الفم الخاصة بك ، وكيفية عزل وفرز البويضات الأنفسية عن طريق تلطيخ Hoechst 33342. لا تنس أن العمل مع والخلايا يتطلب احتياطات خاصة ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية الخاصة بك واستخدام الأدوات المعقمة.