عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوصيف البويضات الجريبية في الفأر بناءً على تنظيم الكروماتين فيها، وذلك وفقًا لقدرتها على دعم تطور جنيني مستقبلي بشكل كامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الأحياء التنموي، مثل كيفية التمييز بين نوعين مختلفين من البويضات الجريبية وعزلهما، وهما البويضات ذات النوية المحاطة (SN)، والبويضات ذات النوية غير المحاطة (NSN)، واللتين تتواجدان في الحجرة الجريبية لمبيض الثدييات. ولحصد المبايض، ابدأ بحقن إناث الفئران التي تتراوح أعمارها بين ثلاثة إلى ستة أسابيع في التجويف البريتوني (IP) بـ 2.5 وحدة دولية من هرمون促 follicle-stimulating hormone المستخلص من مصل الفرس الحامل (PMSG).

بعد يومين، وقبل الحصاد بنحو ساعة واحدة، املأ طبق بتري معقم واحد بوسط M2 وأضف عدة قطرات بحجم 20 µL من وسط M2 إلى طبق بتري ثانٍ، مع تغطية كل قطرة بـ 1.5 mL من الزيت المعدني. ثم انقل جميع أطباق بتري إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 °C و 5% CO2 للسماح للوسط بالوصول إلى حالة الاتزان. بعد ذلك، استخدم مقص تشريح معقم لإجراء شق في الجلد الذي يغطي جدار البطن، يليه شق في البريتون للفأر الأول المحقون بالهرمون.

استخدم ملاقط معقمة لإزاحة الأمعاء جانباً لتحديد موقع قناتي فالوب، اللتين تشكلان شكل حرف V يبدأ من المثانة. بعد تحديد موقع المبيضين أسفل الكليتين، أمسك بإحدى قناتي فالوب وحرر المبيض المقابل لها بإجراء شق صغير في الجزء السفلي من النسيج. كرر العملية لاستئصال المبيض الآخر، ثم ضع كلا المبيضين في طبق بتري مملوء بوسط M2 موازن مسبقاً.

قبل عزل البويضة من التجويف، قم بتصنيع ماصات زجاجية عن طريق الإمساك بطرفي ماصة باستور الزجاجية وتثبيت الماصة أفقيًا فوق لهب موقد بنزن. عندما يبدأ الزجاج في الانصهار، ارفع الماصة عن اللهب واسحب طرفي الأداة بسرعة في اتجاهين متعاكسين. وباستخدام ظفر الإصبع، قم بقص الزجاج الزائد بحزم بالقرب من النقطة الضيقة للماصة لتقصير الطرف، وذلك لتحقيق قطر شعيري داخلي يبلغ حوالي 100 ميكرون.

من المهم اختيار القطر المناسب للماصة؛ فإذا كان القطر ضيقاً جداً، ستتعرض البويضات للانحشار والتفتت والموت. بعد ذلك، قم بتوصيل الطرف غير المعدل من الماصة بأنبوب الشفط.

بعد ذلك، انقُل المبيضين إلى طبق بتري يحتوي على 1 mL من وسط M2 المتوازن مسبقاً، واستخدم إبرة حقنة إنسولين معقمة لثقب الجريبات الغارية في المبيضين برفق. وعند تحرر البويضات، اجمعها برفق باستخدام ماصة فموية، مع الحرص على عدم سحب أي من خلايا الجريب أو بقايا الأنسجة الأخرى. ثم انقل كل بويضة بسرعة بواسطة الماصة عبر عدة قطرات من وسط M2 المتوازن مسبقاً لإزالة جميع خلايا الركام الملتصقة بالمنطقة الشفافة للبويضات.

بمجرد تجريد الخلايا البيضية، قم بترسيبها بعناية في قاع قطرات فردية من وسط M2 المتوازن الطازج. ولصبغ الخلايا البيضية، استخدم ماصة فموية لنقل الخلايا إلى قطرات بحجم 20 µL من صبغة Hoechst 33342، المخففة في وسط M2. بعد ذلك، انقل الخلايا البيضية إلى طبق بتري جديد يحتوي على قطرات بحجم 5 µL من وسط M2 مغطاة بالزيت المعدني، مع الحرص على ترسيب الخلايا البيضية بشكل فردي في قاع كل قطرة.

عند نقل جميع البويضات، ضع الطبق تحت المجهر الفلوري وقم بإثارة الخلايا لفترة كافية فقط لرؤية وجود أو غياب حلقة حول النوية. احرص على عدم تعريض البويضات للضوء بشكل مفرط، حيث يمكن أن يتضرر الكروماتين وقد تموت البويضات إذا تعرضت لفترة طويلة جداً. بعد تحديد البويضات ذات النوية المحاطة بالكروماتين (SN) والبويضات غير المحاطة بالكروماتين (NSN)، قم بفرز الخلايا في أطباق بتري المناسبة والخاصة بكل منها في الكاشف الملائم للتحليل اللاحق المطلوب، وذلك وفقاً لتنظيم الكروماتين فيها.

يُعد صبغ Hoechst 33342 لتنظيم الكروماتين الخطوة الأكثر أهمية على الأرجح في هذا الإجراء. ومن المفترض أن تكون فترة إثارة تتراوح بين 5 إلى 10 ثوانٍ كافية لفرز البويضات بناءً على وجود أو غياب الكروماتين المحيط بالنوية في كل بويضة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في أقل من ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم العمل في درجة حرارة الغرفة والتذكر بضرورة التعامل برفق مع كل من المبيضين والبويضات. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام البويضات في عملية الإنضاج المختبري والإخصاب المختبري. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التنموية للإجابة على سؤال لا يزال قائماً، وهو كيفية التعرف والتمييز بين نوعين من البويضات الجريبية الموجودة في مبايض الثدييات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية صنع واستخدام الماصة الفموية الخاصة بك، وكيفية عزل وفرز البويضات الجريبية عن طريق صبغ Hoechst 33342. لا تنسَ أن العمل مع الحيوانات والخلايا يتطلب احتياطات خاصة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام أدوات معقمة.