DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

الهدف العام من هذا البروتوكول هو اكتشاف تسلسل الحمض النووي الجيني المرتبط بالبروتينات ذات الأهمية في الخلايا الحيوانية عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية. يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة التنظيم النووي والنسخ أو التنظيم في خلايا الثدييات ، مثل تحديد المناطق الجينومية المرتبطة بالأميلويد النووي أو بعوامل نسخ محددة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن التسلسل عالي الإنتاجية يوفر دقة أعلى من أصل DamID الأصلي ، باستخدام المصفوفات الدقيقة للحمض النووي ، وأن هذه التقنية تتيح التحليل المتبادل مع بيانات تسلسل الإنتاجية العالية الخاصة بنا.

سيوضح الإجراء برينان أولسون ، فني من مختبرنا. للبدء ، اتبع بروتوكول النص لاستنساخ الجين محل الاهتمام في متجه DamID. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخزونات فيروسات عدسية تعبر عن DamV5 POY و V5-Dam باستخدام نظام تعبير الفيروسات العدسية.

بتوصيل ناقل DamID مع بلازميدات التعبئة الفيروسية العدسية باتباع إجراء التعداء الأمامي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تأكد من تضمين خطوة ترشيح باستخدام مرشح PVDF بزاوية أربعة نقاط خمسة ميكرون. الآن ، استعد لإصابة الخلايا بفيروس العدس.

قبل يوم واحد ، قم بتمرير الخلايا الملتصقة على أطباق من ستة آبار. استمر في استخدام المضادات الحيوية. الهدف هو أن يكون التقاء بنسبة 50٪ في اليوم التالي للعدوى.

في اليوم التالي ، قم بإزالة المواد الطافية الضاغطية للعدسات المجمدة DamV5 POY و V5-Dam من الفريزر ، وضعها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لإذابة الجليد. على ألواح الاستزراع ، قم بإزالة وسائط النمو واستبدلها بنصف ملليلتر من وسائط النمو الطازجة بدون مضادات حيوية. ثم قم بتحميل الآبار بملليلتر من فيروس العدسات المذاب.

قم بتحميل بئرين مع V5-Dam ، وبئرين مع DamV5 POY ، وبئرين بدون فيروس عدسي كعنصر تحكم سلبي. قم بتدوير المحلول على الخلايا وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة ، استبدل المعلقات الفيروسية على الخلايا بملليلترين من وسائط النمو بدون مضادات حيوية.

ثم استمر في الحضانة لمدة 48 ساعة أخرى. بعد يومين ، أكمل هذه العملية باتباع بروتوكول النص لعزل الحمض النووي الجيني ، والذي يجب أن يستغرق حوالي ساعة. بعد ذلك ، قم بتضخيم شظايا الحمض النووي الميثيل للأدينين من الحمض النووي الجيني.

تستغرق هذه العملية حوالي يومين إلى ثلاثة أيام ، ويتم تغطية التفاصيل في بروتوكول النص. في هذا الإجراء ، قم أولا بتفتيت الحمض النووي الميثيل الأدينين المضخم. قبل استخدام جزء الحمض النووي ، من المهم أولا قياس قوته لتحديد وقت الهضم المناسب.

استخدم أي منتجات ميثيل تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى المتاحة لهذا الاختبار التشخيصي. ابدأ بإعداد مزيج رئيسي يتكون من ستة ميكروغرامات من الحمض النووي ، و 12 ميكرولترا من المخزن المؤقت 10X Fragmentase ، واملأه بالماء حتى 114 ميكرولترا. بعد ذلك ، قم بدوامة مخزون Fragmentase لمدة ثلاث ثوان وأضف ستة ميكرولترات إلى المزيج الرئيسي ليصبح المجموع 120 ميكرولترا.

ثم ، قم بدوامة المزيج الرئيسي لمدة ثلاث ثوان. الآن ، املأ خمسة أنابيب تفاعل ب 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي واحتضان جميع الأنابيب الستة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة أنبوب واحد بعد خمس دقائق ، وأضف خمسة ميكرولترات من EDTA لإيقاف التفاعل.

افعل ذلك كل 10 دقائق حتى يتم جمع جميع أنابيب التفاعل. الآن ، قم بتحليل 12 نقطة خمسة ميكرولتر من كل أنبوب ، وهو ما يعادل حوالي نصف ميكروغرام من الحمض النووي ، ونفس الكمية من الحمض النووي غير المهضوم على هلام أغوروز. من الجل ، حدد الحد الأدنى من الوقت اللازم لهضم غالبية اللطاخة إلى حوالي نقطة صفر كيلو قاعدة.

استخدم هذا كأقصى وقت للهضم. الآن ، قم بإعداد التجزئة الفعلية ، مثل الاختبار المسبق ، وأوقف عمليات الهضم عند ست نقاط زمنية متباعدة بشكل متساو ، بما في ذلك خمس دقائق ، واحسب الحد الأقصى للوقت. بعد الهضم ، اسحب عمليات الهضم الستة وقم بتنقيتها باستخدام مجموعة تنقية PCR ، أو حبات تثبيت صلبة قابلة للعكس في الطور الصلب.

قم بتخفيف الحمض النووي المنقى في حوالي 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت EB. تتمثل الخطوات التالية في إصلاح نهايات الحمض النووي المجزأ ، وإضافة أدينين متدلية ، وربط محولات التسلسل ، وتحويل المحولات على شكل حرف Y إلى حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل. جميع هذه الخطوات مفصلة في بروتوكول النص ، ويجب ألا تستغرق أكثر من يومين لإكمالها.

بعد ربط محولات التسلسل بالحمض النووي المجزأ ، وتحويل المحولات على شكل حرف Y إلى حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل ، حدد أجزاء بالحجم المطلوب. ابدأ بتحضير جل أغوروز بنسبة 2 في المائة في TAE ، واتخاذ الاحتياطات ، أضف بروميد الإيثيديوم إلى التركيز النهائي البالغ 500 نانوغرام لكل ملليلتر. قم بعمل ممرات كافية لجميع العينات وسلمين يحيطان بممرات فارغة.

الآن ، أضف ثمانية ميكرولترات من صبغة التحميل إلى 10 ميكرولتر من كل تحفي من الحمض النووي وقم بإعداد سلم 1 كيلو بايت زائد مع صبغة تحميل 6X وماء بنسبة واحد إلى واحد إلى أربعة. بعد ذلك ، قم بتحميل ممرات الهلام بالترتيب التالي:سلم الحمض النووي ، وتصفية الحمض النووي ، وسلم DNA آخر. بمجرد التحميل ، قم بتشغيل الجل بجهد 120 فولت لكل 60 دقيقة.

في وقت لاحق ، ارتد نظارات السلامة وواقيا للوجه لعرض الجل لفترة وجيزة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من سلالم الحمض النووي لمعرفة ما إذا كان الجل قد نفد بما يكفي بحيث يمكن استئصال ثلاث شرائح هلامية بين 300 و 400 زوج أساسي. بعد ذلك ، قم بقص النطاقات بين 300 و 400 زوج أساسي من كل حارة ، باستخدام شفرة جديدة دائما لكل حارة.

قم بإزالة أقل قدر ممكن من الجل لجعل كل شريحة هلام أقل من 100 ميكرولتر ، وانقل كل منها إلى أنبوب الطرد الدقيق الخاص بها. بعد ذلك ، استخرج الحمض النووي من شرائح الهلام وفقا لبروتوكول النص. استمر في اتباع بروتوكول النص حول كيفية إثراء الأجزاء المعدلة لمحول التسلسل من الحمض النووي المستخرج.

بعد ذلك ، احصل على تحليل عالي الجودة للحمض النووي المنقى بواسطة محلل حيوي ، وإذا كان يلبي التوقعات ، فقم بإرساله للتسلسل. تم تصميم فيروسات العدسات للتعبير عن بروتين اندماج Dam-V5-lamin B1 ، والذي تم التحقق من أنه متزامن مع بروتين لامين B1 الداخلي عن طريق تلطيخ التألق الأميني. تم استخدام كل من فيروس العدسات هذا وفيروس العدسات الضابط الذي يعبر عن بروتين اندماج Dam-V5 لإصابة الخلايا العضلية C2C12 بالفئران.

تم جمع الحمض النووي وتضخيمه لشظايا الأدينين الميثيلية ، كما هو موضح ، ثم تسلسلها. ثم تم إنشاء خرائط تفاعل الجينوم NL للكروموسوم الأول. يظهر مسار واحد نسب log2 RPKM.

المسار الآخر المجالات المرتبطة بالصفيحة باللون الأسود. هذه هي المناطق التي ترتبط بشكل ملحوظ بسد لامين B1 أكثر من سد التحكم. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوعين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف تسلسل الحمض النووي المرتبط بالبروتينات ذات الأهمية عن طريق تسلسل عالي الإنتاجية ، إلى جانب DamID. لا تنس أن العمل مع بروميد الإيثيديوم ومصابيح الأشعة فوق البنفسجية قد يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل انتظار هلام ليبرد قبل إضافة بروميد الإيثيديوم ، وارتداء واقي العين وواقي الوجه أثناء تنفيذ هذا الإجراء.