زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة

الهدف العام من إجراء استئصال الأنسجة خارج الجسم (ex vivo explant) هذا هو تحسين عملية جمع وتوسيع نطاق تطبيق الخلايا الظهارية الداخلية الطيرية، وذلك لدراسة وظيفة الإنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام العناصر الغذائية من قبل الأجنة الطيرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق باستخدام الدهون أثناء التخلق الجنيني للطير، مثل كيفية تعبئة دهون المح وجلبها من المح إلى الجنين خلال المراحل المتأخرة من النمو. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا على استئصال خلايا ظهارية داخلية وظيفية بنجاح من غشاء كيس المح لسمان اليابان، والتي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة التطور الجنيني للطير.

ابدأ بتحضير محلول PBS بتركيز 10x كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بتخفيف هذا المحلول المخزون بنسبة واحد إلى عشرة لتحضير PBS بتركيز 1x، والذي سيُستخدم لغسل غشاء الكيس المحي أثناء تشريح الأديم الباطن. ولتحضير وسط النمو للخلايا الظهارية في الأديم الباطن، أو EECs، قم أولاً بتدعيم DMEM/F-12 بنسبة 10% من مصل العجول حديثي الولادة و 1% من محلول البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين.

بعد ذلك، قم بإدخال مسبار مقياس pH في وسط DMEM الذي تم تحضيره مسبقاً. أضف حمض HCl العادي ثلاثي التركيز قطرة تلو الأخرى إلى الوسط حتى يتم ضبط قيمة pH لتصل إلى 7.2. بعد جمع حوالي 24 بيضة سمان مخصبة، ضعها عمودياً في حاويات البيض بحيث تكون نهاياتها العريضة غير المدببة، حيث توجد الخلايا الهوائية، متجهة إلى الأعلى.

بعد ذلك، انقل البيض إلى حاضنة جيدة التهوية مضبوطة عند 37 درجة مئوية. وبعد خمسة أيام من التحضين، افحص البيض باستخدام جهاز كاشف البيض (egg candler). إذا تطورت الأجنّة بشكل طبيعي، فمن المتوقع رؤية هيكل دائري من الأوعية الشعرية أسفل الغرفة الهوائية.

اختر بيضة تظهر تطوراً طبيعياً للشعيرات الدموية، ونظف القشرة بالماء العذب والإيثانول بتركيز 75%. بعد ذلك، افتح قشرة البيضة من موقع الغرفة الهوائية باستخدام المقص. استخدم الملقط للمساعدة بلطف في سكب محتويات البيضة في طبق زراعة فارغ بقطر 10 cm.

بعد ذلك، استخدم المقص لفصل الجنين والمح، وأي ألبومين من غشاء الكيس المحي، والذي يُرمز له اختصاراً بـ YSM. وبمجرد عزله، اغسل YSM ثلاث مرات في 1x PBS، ثم انقله إلى طبق جديد بقطر 10 cm يحتوي على PBS. بعد ذلك، ضع الطبق تحت مجهر تشريحي.

بعد ذلك، ابدأ بإزالة أي بقايا من بياض البيضة، والتي تلاصق طبقة الأديم الظاهر الخارجية لغشاء الكيس المحي (YSM)، باستخدام المقص. تابع باستخدام الملقط لرفع الأديم الظاهر الشفاف والأديم المتوسط الهيكلي الشعيري الأحمر من حافة الأديم المتوسط الموجود على غشاء الكيس المحي. ثم، قم بتقشير الأديم الظاهر والأديم المتوسط معاً بلطف لعزل طبقة خلايا الأديم الباطن الكامنة أسفلهما.

بعد ذلك، استخدم زوجاً من الملاقط للإمساك بإحكام بطبقة الخلايا الأديمية الباطنة الصفراء للغشاء. وبزوج آخر، أمسك بوسط الجنين الشعيري، ثم ابدأ بسحب الأديم المتوسط بعيداً عن حافة الالتقاء بين الأديم المتوسط والأديم الباطن. وباستخدام مقص، اقطع ما تبقى من طبقة الأديم الباطن الصفراء، وانقلها إلى طبق زراعة بقطر ستة سنتيمتر مملوء بوسط النمو.

باستخدام قطارة، انقل الأديم الباطن الأصفر الفاتح من طبق الزرع الذي يبلغ قطره ستة سنتيمترات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL بعد جمع الغشاء المحي، وأضف إليه 15 mL من وسط النمو المُحضَر مسبقاً. ضع الأنبوب المخروطي في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degrees Celsius حتى يتم الانتهاء من جميع عمليات جمع الأنسجة. ابدأ بإذابة 6.5 units من Type IV collagenase في 10 mL من DMEM.

بعد ذلك، قم بتركيز الأنابيب التي تحتوي على الأديم الباطن باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 130 ×g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. وعقب عملية الطرد المركزي، قم بشفط الوسط، واستخدم قطارة لنقل جميع عينات الأديم الباطن إلى طبق زرع بقطر ستة سنتيمتر. ثم أضف 1 mL من محلول الكولاجين إلى الطبق.

باستخدام مقص منحني، قم بتقطيع الأديم الباطن الذي تم جمعه من أربعة أجنة سمان إلى شرائح يتراوح حجمها بين 2 إلى 3 mm تقريبًا. بعد ذلك، اجمع الشرائح في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL، مع 9 mL من محلول collagenase طازج موجود مسبقًا داخل أنبوب الطرد المركزي سعة 50 mL. ولتحسين تكاثر الخلايا خلال مرحلة الاستنبات، ضع الأنبوب في حمام مائي هزاز مضبوط على درجة حرارة 37 °C.

بعد ذلك، يتم تحضين الأنبوب المخروطي لمدة 30 دقيقة لهضم الأنسجة جزئياً باستخدام الكولاجيناز. ويُعد الهضم البروتيني الجزئي أهم خطوة لتحسين جودة الخلايا المستخلصة من الأديم الباطن لغشاء كيس المح. وتظهر بياناتنا تحسناً ملحوظاً في معدل نجاح المزارع الخلوية وتكاثر الخلايا من خلال إجراء الهضم بالكولاجيناز.

بعد الهضم بواسطة الكولاجيناز، يتم طرد الأنسجة مركزياً بقوة 130 ×g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تُزال الطبقة الطافية باستخدام ماصة. يتبع ذلك غسل الراسب عن طريق إعادة تعليقه في 20 mL من DMEM. يتم طرد الأنبوب مركزياً كما وُصف سابقاً، ثم تُزال الطبقة الطافية بعد ذلك، ويُعاد تعليق الراسب في 12 mL من وسط النمو.

بعد ذلك، أضف بلطف 500 µL من المعلق إلى كل بئر في طبق يحتوي على 24 بئراً. ثم قم بتحضين مستنبتات الأديم الباطني لمدة يومين عند 37 °C في 5% CO2. وخلال هذه الفترة، يُتوقع أن تتكاثر الخلايا خارج الأنسجة.

بعد ذلك، قم بتحضين الخلايا لمدة يومين آخرين. ثم، أخضعها لاختبار حيوية الخلايا، وقم بتصور النتائج باستخدام قارئ الأطباق. بعد ذلك، قم بإجراء RT-qPCR لتقييم مستويات تعبير المؤشرات ذات الصلة في EECs وتحقق من حجم ناتج RT-qPCR عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام كما هو موضح في البروتوكول النصي.

بالمقارنة مع المستنبتات غير المعالجة، أظهرت المستنبتات التي خضعت لهضم جزئي باستخدام collagenase زيادة ملحوظة في تكاثر الخلايا، كما هو موضح في هذه الرسوم البيانية والمحدد بواسطة اختبار t-test المزدوج، مما يثبت نجاح نظام الزراعة. ولتقييم تأثيرات الإنزيمات الأخرى، أُجريت اختبارات حيوية الخلايا للأنسجة المعالجة بـ collagenase و dispase أو بـ collagenase وحده. وخلال الأيام الخمسة الأولى من الحضن، كان نمو الخلايا متشابهاً في كلتا الحالتين.

ومع ذلك، من اليوم السادس إلى التاسع، تكاثرت الخلايا الظهارية المعوية (EECs) المعالجة بالكولاجيناز فقط بشكل مطرد، مما يشير إلى أن الهضم الجزئي باستخدام هذا الإنزيم يحسن النمو ويجب استخدامه بشكل تفضيلي. وعند فحص الخلايا الظهارية المعوية المستزرعة بصرياً، أظهرت سمات مشابهة للخلايا الدهنية تتمثل في وجود قطرات دهنية دائرية كبيرة كما هو موضح هنا. وكانت هذه الخلايا أيضاً إيجابية لصبغة Oil Red O، والتي تُستخدم عادةً لتحديد الخلايا الدهنية.

ودعماً لهذه البيانات المورفولوجية، كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (real-time quantitative PCR) أن خلايا EECs المستنبتة تظهر مستويات عالية من SOAT1، وهو بروتين يقوم بتخليق إستر الكوليسترول من الكوليسترول. ويشير هذا بشكل أكبر إلى أن خلايا EECs المستنبتة تظهر الخصائص الفسيولوجية الصحيحة للخلايا الدهنية. والأهم من ذلك، أنه عند تعريض خلايا EECs لـ IBMX و Forskolin، وهما عاملان يزيدان من مستويات أحادي فوسفات الأدينوسين الحلقي (cAMP)، واستنباتها لمدة 24 ساعة، حفز كلا العلاجين تعبير SOAT1، مما يشير إلى آليات محتملة لتنظيم SOAT1 واستخدام الدهون في YSM.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات تقريبًا، وهي فترة زمنية تتيح جمع ثلاث عينات على الأقل. وعقب اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق مثل SOAT1 أو مقايسات النشاط الإنزيمي الأخرى، بالإضافة إلى تأكيدات بصرية مماثلة. وقد تساعد هذه المقايسات في الإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية مشاركة بروتينات ومغذيات كبرى معينة في المراحل المتأخرة من التطور الجنيني.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال استهلاك العناصر الغذائية الجنينية لاستكشاف الآلية المحتملة التي يتم من خلالها استهلاك العناصر الغذائية ونقلها في نموذج جنيني للطيور. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على تعلم كيفية جمع أنسجة الأديم الباطن من أجنة الطيور، ومعرفة كيفية زراعة خلايا EECs لدراسة نقل واستهلاك العناصر الغذائية الجنينية باستخدام نموذج الطيور.