تحديد كينيسين-1 الشحنات عن طريق الميكروسكوب الإسفار

الهدف العام من هذه المنهجية هو تحديد شحنات كينيسين -1 باستخدام المجهر الفلوري. تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المحركات الجزيئية ، مثل الشحنات التي تحملها كينيسين وميوسينات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن طفرات KIF5B السلبية السائدة يمكن أن تساعدنا في التعرف بصريا على هذه الشحنة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

للبدء ، بالنسبة للخلايا الحية أو التصوير الفلوري غير المباشر عند 40X أو أقل ، قم بتغذية 0.2 إلى 0.3 مليون خلية HeLa في مليلتر واحد من الوسط الكامل في كل بئر من ستة ألواح آبار. قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة لدراسات الفلورسنت المناعي غير المباشر ذات التكبير فوق 40X ، في خزانة السلامة الحيوية لتجنب التلوث ، استخدم الكحول المطلق لغسل أكواب الغطاء ووضعها في آبار صفيحة من ستة آبار لتجف في الهواء.

عندما تجف زلات الغطاء ، ضعها في الآبار وبذرها من 0.2 إلى 0.3 مليون خلية في مليلتر واحد من DMEM الكامل في كل بئر من اللوحة. استزراع الخلايا بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، داخل خزانة السلامة الحيوية ، استخدم 0.1 مل من وسط التعدي لتخفيف 0.6 ميكروغرام من النوع البري الموسوم ب tdTomato-أو بلازميد التعبير عن KIF5B بدون محرك مع أو بدون بلازميد يعبر عن بروتين شحن مرشح.

في أنبوب آخر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.6 مليلتر ، أضف 1.8 ميكرولتر من كاشف التعدي إلى 0.1 مل من وسط التعداد. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 0.1 مل من كاشف التعداء المخفف إلى عينات الحمض النووي المخففة.

اقلب الأنابيب لخلط المحتويات وتدور لأسفل لمدة خمس ثوان. ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. خلال فترة الحضانة لتشكيل مركب التعدي ، استخدم PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات.

ثم أضف 0.8 ملليلتر من وسط التعداء الدافئ مسبقا إلى كل بئر ، وأعد الألواح إلى الحاضنة. بعد تحضين كاشف التعداء المخفف لمدة 45 دقيقة ، أضف 0.2 ملليلتر من المحلول بالتنقيط في كل بئر من اللوحة. هز صفيحة الآبار الستة برفق لمدة خمس ثوان وأعدها إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات.

ثم استخدم DMEM الكامل لاستبدال الوسيط. لإجراء تصوير الخلايا الحية بعد 16 ساعة إضافية من الحضانة ، أضف صبغة إقحام الحمض النووي Hoechst 33342 إلى الوسط إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومولار واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام هدف 40X ، افحص الخلايا للتعبير عن بروتينات الفلورسنت.

لإجراء التألق المناعي غير المباشر على الخلايا التي تم تحضينها بكاشف التعداد: بعد تحضير بارافورمالدهيد وفقا لبروتوكول النص ، استخدم PBS بدرجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا عن طريق تدوير لوحة الآبار الستة لمدة خمس ثوان. أضف ملليلترا واحدا من 4٪ بارافورمالدهيد طازج و PBS لكل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم PBS لغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تدوير اللوحة والتخلص من المحلول.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحدا من 0.1٪ Triton-X 100 في PBS إلى كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لاختراق الخلايا. ثم استخدم PBS لغسل الخلايا أربع مرات ، وتخلص من المحلول بعد كل غسلة. أضف الأجسام المضادة الأولية واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة مع التأرجح لمدة أربع ساعات.

بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل الخلايا أربع مرات عن طريق تحريك اللوحة. ثم أضف ملليلترا واحدا من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بصبغة الفلورسنت واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع التأرجح لمدة ساعتين. بعد غسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS ، أضف ملليلترا واحدا من DAPI واحتضنه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.

في حالة استخدام زجاج الغطاء مع العينات ، ضع 10 ميكرولترات من محلول التثبيت في وسط شريحة المجهر وقم بتركيب غطاء زجاجي فوق محلول التثبيت. ثم احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم طلاء الأظافر لإغلاق الحواف واحتضانه في الظلام في غطاء الدخان طوال الليل.

لإجراء الفحص المجهري الفلوري ، استخدم هدف 40X مع مجموعات المرشحات ل DAPI و CFP و FITC و Cy3 عند الاقتضاء. كما هو موضح هنا ، ظهر KIFB من النوع البري المعبر عنه خارجيا بشكل متجانس في السيتوبلازم ، بينما ظهر c-MYC بشكل أساسي في النواة. ومع ذلك ، فإن متحولة KIF5B بدون محرك شكلت مجاميع في السيتوبلازم مما أدى إلى تجميع c-MYC.

بالإضافة إلى ذلك ، أدى KIF5B بدون محرك أيضا إلى تجميع c-MYC الداخلي وعامل النسخ p53 ، مما يشير إلى أن c-MYC و p53 كلاهما شحنات Kinesin-1 و KIF5B ينظم التوطين الخلوي لكل من البروتينات الداخلية. يوضح هذا الشكل أن حركة عوامل النسخ بواسطة KIF5B تبدو محددة لأن التعبير عن طفرة KIF5B بدون محرك لم يؤثر على التوطين الخلوي تحت الخلوي ل c-Fos أو يتسبب في تجميعه. تكشف هذه البيانات أن الطريقة الموضحة في هذا الفيديو تسمح بتحديد خصوصية عالية لشحنات كينيسين -1.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحركينات الأكثر ملاءمة للخلايا التي تحتوي على حجم كبير من السيتوبلازم بحيث يمكن بسهولة ملاحظة التراكم في السيتوبلازم. بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المحركات الجزيئية لبناء طفرات سلبية سائدة مماثلة من كينيسين وميوسينات أخرى من أجل تحديد شحناتهم الخاصة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الطفرة السالب السائدة للمحرك الجزيئي لتحديد هذه الشحنة ، باستخدام المجهر الفلوري.

لا تنس أن العمل مع الفينو وبروميد الإيثيديوم وبارافورمالدهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات لتجنب ملامسة الجلد المباشر معهم أثناء تنفيذ هذا الإجراء. شكرا للمشاهدة. حظا سعيدا في تجربتك.