عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الكريات البيض المتسللة للجلد باستخدام الهضم الأنزيمي وفصل تدرج الكثافة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية في العديد من نماذج الفئران لأمراض الجلد ، بما في ذلك التهاب الجلد التأتبي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الكريات البيض التي تتسلل إلى الجلد ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التحقيق في مجموعات الخلايا المقيمة الأخرى.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع حصاد الجلد ، والذي يتضمن الإزالة الكاملة للأنسجة الدهنية والضامة الزائدة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم حصاد الجلد والتعامل مع تدرج الكثافة ، ويتطلب الدقة والممارسة. في الوقت المناسب بعد العلاج ، استخدم مقصا جراحيا بطول 10 سم لاستئصال منطقة 25 × 25 ملم من جلد الخاصرة المحلوق بعناية من أنثى بالغة تبلغ من العمر ثمانية إلى اثني عشر أسبوعا من أنثى ND4 Swiss-Webster.

استخدم شفرة جراحية نظيفة وحادة لكشط الدهون الزائدة والأنسجة الضامة من الجلد ، ثم انقل الجلد إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 مل من HBSS بدرجة حرارة الغرفة مكمل ب EDTA و HEPES و FBS ، وقم بهضم الأنسجة مسبقا على صفيحة دوارة لمدة 30 دقيقة في مكان جاف غير غازي ، حاضنة 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير الأنبوب بقوة لمدة عشر ثوان وقم بتصفية ملاط الأنسجة من خلال مصفاة 70 ميكرون. بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط لنقل قطع جلد الخاصرة من المصفاة إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على عشرة ملليلتر من وسائط HBSS الطازجة بدرجة حرارة الغرفة ، مكملة ب EDTA و HEPES و FBS ، ثم استخدم زوجا من مقص التشريح الجراحي بطول 12.5 سم لفرم كل قطعة من جلد الخاصرة بحيث يبلغ متوسط حجم قطعة الأنسجة حوالي 2.2 × 2.2 ملليمتر.

عندما يتم فرم جميع القطع ، أعد الأنبوب إلى اللوحة الدوارة لمدة 30 دقيقة أخرى للحضانة. قم بتدوير الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان في نهاية الحضانة وقم بتصفية المحتويات من خلال مصفاة 70 ميكرون. اجمع قطع جلد الخاصرة المتبقية في أنبوب جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS مكملا ب 0.7 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجيناز D ، وأعد الأنبوب إلى اللوحة الدوارة لمدة 30 دقيقة أخرى للحضانة.

بعد 10 ثوان أخرى من الدوامة ، قم بتصفية محتويات الأنبوب مرة أخرى ، وهذه المرة تخلص من الحطام الموجود على المصفاة ، ثم املأ الأنبوب بما يصل إلى 50 مل من HBSS ، EDTA ، HEPES ، FBS ، قم بتدوير الخلايا وصب المادة الطافية. أضف ثلاثة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ، ووسط طرد مركزي متدرج كثافة 67 في المائة في PBS إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة 44 في المائة من وسط الطرد المركزي المتدرج الكثافة في HBSS مع الفينول الأحمر. اضبط الماصة على أقل سرعة، ضع الماصة على جانب الأنبوب وقم بوضع طبقة برفق من الخلايا فوق وسط الطرد المركزي المتدرج بكثافة 67 بالمائة.

عند العمل مع تدرجات الكثافة، احرص على تجنب تكوين فقاعات وتقليل أي اضطرابات في واجهة التدرج. ثم افصل الخلايا باستخدام ماصة نقل سعة خمسة ملليلتر لتجميع الخلايا في الواجهة في نهاية الطرد المركزي. نظرا لأن وضع طبقات التدرج برفق واستخراج واجهة التدرجات بعناية من الخطوات الحاسمة ، فمن الحكمة ممارسة طبقات وسيط الطرد المركزي المتدرج للكثافة وإزالة الواجهة مع تعليق خلايا طحال الفئران قبل محاولة الإجراء مع الخلايا التجريبية ذات الأهمية.

أخيرا ، اغسل الخلايا التي تم جمعها في PBS المثلج المكمل ب FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد التريبان الأزرق. لا يتأثر التعبير السطحي CD4 و CD8-alpha بهضم الكولاجيناز D ، حيث يتم اكتشاف نفس العدد من الخلايا الإيجابية CD4 و CD8-alpha الإيجابية مع أو بدون الهضم الأنزيمي. علاوة على ذلك ، لا يظهر هضم الكولاجيناز D أي تأثير على كثافة سطح علامات تنشيط الخلايا التائية CD44 و CD62L على الخلايا التائية الإيجابية CD4.

بعد فصل التدرج ، يتم عزل حوالي 250 خلية مناعية قابلة للحياة لكل ملليمتر مربع من أنسجة الخاصرة من Oxazolone ، أو الفئران التي تواجه تحديا في الثور ، مقابل أربع خلايا مناعية قابلة للحياة فقط لكل ملليمتر مربع من الأنسجة في الفئران التي تواجه تحديا للمركبات ، والتي تم توعيسها سابقا ب Ox.95 في المائة من الخلايا المفردة ذات المظهر الأمامي والجانبي المنخفض في الفئران التي تواجه تحديا للثور ، و 71 في المائة من هذه الخلايا في الضوابط التي تواجه تحديا في المركبات هي خلايا موجبة CD45 حية ، أي ما يعادل زيادة بمقدار 67 ضعفا تقريبا في خلايا المناعة الإيجابية CD45 المتسللة في جلد الخاصرة بعد ثلاثة تحديات يومية للثور. في الواقع ، ينتج عن تحدي الثور تسلل واضح للخلايا التائية والعدلات إلى جلد الخاصرة ، مع 42 في المائة من الخلايا المفردة الحية CD45 الإيجابية في المعالجة بالثور ، والعدلات الإيجابية الظاهرة Gr-1 ، وحوالي 84 في المائة من الخلايا التائية الإيجابية CD3 التي تعبر عن CD8-alpha ، أو CD4 ، مقارنة بالحيوانات المضطربة المعالجة بالإيثانول. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع تدرج الكثافة بعناية. لا تنس دائما استخدام وسيط الطرد المركزي المتدرج بكثافة درجة حرارة الغرفة عند تنفيذ هذا الإجراء. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل قياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا أو نقل الخلايا أو زراعة الخلايا في المختبر لتقييم النمط الظاهري ووظيفة الكريات البيض المتسللة إلى الجلد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الكريات البيض المتسللة للجلد باستخدام الهضم الأنزيمي والطرد المركزي المتدرج الكثافة.