Name: فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: اكتشف تقنية BrdU-ChIP-Slot-Western لفحص البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الوليد في خلايا الثدييات. توفر هذه الطريقة الكشف السريع والكمي الدقيق عن تفاعلات البروتينات أثناء تكرار وإصلاح DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد العمل في هذه المخطوطة من أموال من قسم علاج الأورام بالإشعاع ومعهد هانتسمان للسرطان والمعهد الوطني للصحة منح (R01-CA188520) لSB. أشكر دانييل جونسون وستيفن بينيت في مختبري ليدل على البروتوكول وشرح فوائدها. وأنا ممتن للدكتور ماهيش شاندراسيخاران (معهد هانتسمان للسرطان) للتعليق الحرجة على المخطوطة.

1. لونين مناعي (رقاقة) بعد BrdU وصفها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا NIH3T3 في وجود إما DMSO أو مثبطات HDAC1،2 انتقائية كما هو موضح سابقا 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج مع DMSO أو مثبطات انتقائية HDAC1،2، إضافة BrdU إلى الخلايا في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة. احتضان 2 × 10 6 NIH3T3 خلايا مطلي في 10 مل سائل الإعلام NIH3T3 مع 20 ميكرومتر تركيز النهائي من bromodeoxyuridine (BrdU) لمدة 60 دقيقة في العقيمة 37 ° C زراعة الأنسجة الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشعبي البروتينات داخل الخلايا لDNA عن طريق إضافة الفورمالدهيد مباشرة إلى وسائل الإعلام الثقافة بتركيز نهائي من 1٪. احتضان 2 × 10 6 خلايا NIH3T3 مع الفورمالديهايد في RT لمدة 10 دقيقة على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد عبر ربط بإضافة الجلايسين إلى التركيز النهائي من 125 ملم. في احتضان RT لمدة 5 دقائق على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام وجمع الخلايا في برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور سلليرة سورية في 956 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. غسل بيليه الخلية مرتين مع PBS الجليد الباردة. إزالة PBS من الأنبوب. تخزين بيليه الخلية عبر ربط دون PBS (طاف) في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المحللة من بيليه الخلية crosslinked بإضافة 500 ميكرولتر العازلة FA140 (50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القص لونين من قبل sonicating عينات خمس مرات في السلطة 35٪ مع وجود نبض 15 ثانية، 0.9 ثانية على والإعداد 0.1 ثانية قبالة. إبقاء الأنابيب على الجليد بعد كل جولة من صوتنة لتجنب تسخين العينات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من القص على هلام DNA كما كفاءة القص تتنوع بين sonicators مختلفة. للتحقق صوتنة، عكس تشعبي عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M وتنفيذ الخطوات 1.17.1. - 1.22. تشغيل مزال 10 DNA ميكرولتر على 1.5٪ هلام الاغاروز للتحقق ما إذا كان القص هوبين 300-700 سنة مضت بمتوسط ​​كثافة في 500 سنة مضت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد صوتنة، وعينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 17949 x ج في 4 درجات مئوية، وطاف لنقل أنبوب جديد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تقدير البروتين باستخدام عدة فحص البروتين التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. استخدام كمية مساوية من المحللة للرقاقة الرقابة والعينات التجريبية. عموما، استخدم 1 ملغ من المحللة الكلي في رد الفعل الشذرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50٪ من البروتين الطين A-الاغاروز باستخدام العازلة FA140 تحتوي على مثبط البروتياز كوكتيل. إضافة 10/01 حجم كوكتيل مثبط البروتياز. حساب حجم حبات اللازمة استنادا إلى عدد من العينات في المجموع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البروتين الخرز A-الاغاروز مع العازلة FA140 مرتين لإزالة العازلة التخزين وإضافة حجم مساو لعازلة FA140 إلى حبات لجعل 50٪ الطين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة البروتينات التي تربط غير تحديدا إلى الخرز، وإضافة 50 ميكرولتر من 50٪ من البروتين الطين A-الاغاروز وcubate العينات عند 4 درجات مئوية مع ثابت نهاية الإفراط في نهاية التناوب في خلاط المشواة لمدة 30 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينات في 956 x ج في 4 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. جمع طاف وأداء مناعي عن طريق إضافة 8 ميكرولتر H4K16ac الأجسام المضادة أو 5 ميكرولتر (5 ميكروغرام) من 1 ملغ / مل الأجسام المضادة SMARCA5 لطاف. احتضان عند 4 درجات CO / N مع ثابت التناوب نهاية الإفراط في نهاية في خلاط المشواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ 1/10 للاستخراج من أجل السيطرة &quot;الإدخال&quot; وتعيينه جانبا في -20 ° C. المدخلات يجب أن يكون العكس يرتبط العابرة جنبا إلى جنب مع عينات IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كمية مساوية من أرنب مفتش (5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل) على أنها سلبية العينة الضابطة مناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من 50٪ بروتين-A الاغاروز الطين لاستخراج واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخرز agarose بواسطة الطرد المركزي في 956 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية وطاف واSH حبات مع المخازن المؤقتة التالية بالتتابع. في الاستعدادات العازلة، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني الحق قبل الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع منخفضة الملح المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (FA140؛ تركيز النهائي من 50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) ل 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل عالية من الملح المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (FA500؛ تركيز النهائي من 50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) ل 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل LiCl المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (تركيز النهائي من 10 ملم من تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0، 250 ملي من LiCl، و 0.5٪ و 0.5٪ NP40 deoxycholate الصوديوم) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد يغسل كما هو موضح أعلاه، إضافة 200 حل شطف ميكرولتر (تركيز النهائي من 1٪ SDS وبيكربونات الصوديوم 100 ملم) وincubatه في RT لمدة 15 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية تناوب على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينات في 956 x ج في RT ونقل شطافة لأنبوب جديد 1.5 مل. كرر الخطوة 1.15 مع إضافي الحل شطف 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 ميكرولتر من شطافة، إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M وتخلط جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك، إضافة 400 ميكرولتر حل شطف إلى 10 ميكرولتر المدخلات التي تم تعيينها جانبا (الخطوة 1.11) وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M لعكس عينات المدخلات تشعبي كذلك. عكس تشعبي العينات التي يحتضنها في 65 ° C حمام الماء لمدة 5 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من 100٪ ETOH إلى شطافة crosslinked للعكس. تخلط جيدا واحتضان عند -80 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة أو في -20 درجة CO / N. تدور العينات في 17949 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 800 ميكرولتر 70٪ من الإيثانول لغسل بيليه. تدور في 17949 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل الايثانول. تدور لفترة وجيزة لإزالة أي الإيثانول المتبقية. الهواء الجاف العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة الإيثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الحمض النووي في 90 ميكرولتر ريبونوكلياز والدناز المياه المجانية وإضافة 2 ميكرولتر 10 ملغ / مل ريبونوكلياز في 0.2 ملغ / مل تركيز النهائي. احتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر 10X بروتين K العازلة (100 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 5٪ SDS). تخلط جيدا وإضافة 1 ميكرولتر بروتين K. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية المدخلات ورقاقة الحمض النووي باستخدام PCR تجارية عدة تنقية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة وأزل الحمض النووي في 50 ميكرولتر المياه. متجر DNA في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol> 2. فتحة تحليل لطخة من رقاقة الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس العائد من المدخلات ورقاقة الحمض النووي مزال في 50 ميكرولتر المياه كما هو موضح في الخطوة 1.22 باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 280 نانومتر وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ كميات متساوية (50 ميكرولتر) من المدخلات أو DNA immunoprecipitated التي هي ضمن مجموعة خطية من الكشف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال، إذا كان الإدخالالعائد DNA هو 1.5 نانوغرام / ميكرولتر، ثم تأخذ 30 ميكرولتر (أو 45 نانوغرام DNA الكلي) وجعل حجم 50 ميكرولتر بالماء. للعامل رقاقة، واتخاذ كامل شطافة 50 ميكرولتر من الخطوة 2.1 وانتقل إلى الخطوة 2.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد 50 ميكرولتر المدخلات أو DNA immunoprecipitated بإضافة 2.5 حجم 0.4 N هيدروكسيد الصوديوم، دوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي ل956 x ج لمدة 10 ثانية، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد الحمض النووي التشويه والتحريف عن طريق إضافة 175 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، دوامة، الطرد المركزي لمدة 956 x ج لمدة 10 ثانية، ووضع العينات في الثلج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيف المتسلسل من المدخلات وDNA immunoprecipitated للفتحة وصمة عار الفحص كما هو موضح أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،3-2،4 للحصول على حجم العينة الكلي 350 ميكرولتر (أي 50 ميكرولتر الإدخال / رقاقة الحمض النووي، 125 ميكرولتر 0.4 N هيدروكسيد الصوديوم، 175 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8). ملاحظة: للحصول على سبيل المثال ذكر أعلاه، فإن 45 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات في نهاية الأمر 0،129 نانوغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لDNA المدخلات، وتسمية ثلاثة أنبوبالصورة الى 100 و 50 و 25 و إضافة 100 ميكرولتر، 50 ميكرولتر و 25 ميكرولتر من عينة DNA التشويه والتحريف وتحييدها. جعل الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. لرقاقة الحمض النووي، وتسمية ثلاثة أنابيب إلى 200 و 100 و 50 و 200 إضافة ميكرولتر 100 ميكرولتر و 50 ميكرولتر من عينة DNA التشويه والتحريف وتحييدها. جعل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر مع المياه مجانا نوكلياز. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غشاء لحجم الجهاز فتحة وصمة عار. قبل الرطب الغشاء وأوراق النشاف في 20x وSSC قبل وقبل إضافة DNA. تجميعها في الجهاز فتحة وصمة عار وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA الماصة من الخطوة 2.5.2 في فتحات مناسبة. تطبيق فراغ ببطء لسحب DNA على الغشاء زيتا التحقيق. وقف فراغ بعد مرور جميع العينات من خلال جهاز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك الجهاز وشل على الفور DNA على الغشاء باستخدام crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. هل لديك الجانب DNA حتى في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية واستخدام الاتحاد الافريقيtocrosslink وضع في crosslinker. اتبع بروتوكول الشركة الصانعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف BrdU على فتحة لطخة عن طريق أداء الغربية النشاف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الغشاء مع 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في PBS تحتوي على 0.1٪ توين-20 (PBST) لمدة 1 ساعة على RT لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة للغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الابتدائي الأجسام المضادة لمكافحة BrdU (1: 500 تمييع) المخفف في 1٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في PBST واحتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 3 ساعة على RT على شاكر. يغسل الغشاء مع PBST ثلاث مرات بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة HRP-مترافق مكافحة فأر الضد الثانوية إلى وصمة عار (1: 5000 تمييع) واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء مع PBST ثلاث مرات بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية. ملاحظة: استخدم حجم ما يكفي من الأجسام المضادة لتغطية كامل الغشاء خلال حضانات الضد الابتدائية والثانوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج ECL وإضافته إلى ميلان وصمة عارحبال لبروتوكول الشركة المصنعة. احتضان الغشاء مع ECL المزيج لمدة 5 دقائق على RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الغشاء في كاسيت الأشعة السينية، كشف الغشاء إلى فيلم الأشعة السينية وتطوير وصمة عار باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس إشارة التي تم الحصول عليها لإدخال وDNA ChIPed بعد مسح البقع باستخدام صورة البرنامج J وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. لالكميات، استخدم إشارة إلى أن ضمن مجموعة خطية من الكشف لضمان دقة القياس. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li>
<li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

ليس لدي مصالح مالية متنافسة.

بروتوكول صفها في هذه المخطوطة هي طريقة سريعة نسبيا لإثبات وجود البروتينات أو أشكالها المعدلة بعد translationally على DNA تكرارها حديثا أو الناشئ. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه التقنية واحدة لقياس حركية جمعية-تفكك البروتين أو شكله المعدل مع الحمض النووي الناشئ. هذه التقنية هي مكملة لتكنولوجيا أنيقة iPOND 13. في التكنولوجيا iPOND، هو المسمى DNA تصنيعه حديثا مع deoxyuridine الإيثيلي (EDU). ثم يتم إضافة المترافقة البيوتين على EDU باستخدام النقر الكيمياء. ثم يتم immunoprecipita...

إصلاح الحمض النووي عيب و / أو تكرار الحمض النووي هي السبب الرئيسي لعدم الاستقرار الجينوم، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا. وحيد دون اصلاح كسر حبلا مزدوج يكفي ليسبب موت الخلايا 1. يتم تبديل المنظمة لونين عابر خلال كل تكرار وإصلاح 2،3، والفشل في الحفاظ على المعلومات جينية خلال هذه العمليات سوف يؤدي إلى تهديد للسلامة الجينوم. فقدان HDAC3 أو وظيفة HDAC1،2 يعوق التقدم S-المرحلة، والنسخ وإصلاح الحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد السمية (تلف DNA) وموت الخلايا 4-9. وبالتالي فإنه من استراتيجية عملية لاستخدام مثبطات انتقائية HDAC لتعطيل النسخ المتماثل إصلاح والكروماتين في الخلايا السرطانية وتسبب التلف في الحمض النووي، والتي بدورها يمكن أن يوقف النمو ولحث على موت الخلايا بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية سريعة النمو. خلال تكرار الحمض النووي، وتفكيكها لونين بسرعة ومن ثم تجميعها بعد تكرار الحمض النووي. سي حديثاوالأسيتيل nthesized هيستون H4 في K5 والمخلفات K12 (H4K5K12ac) وترسب التالية على لونين، وdeacetylated أنها بسرعة عن طريق deacetylases هيستون (HDACs) 10،11. يمكن فشل الخلايا للحفاظ على لونين سلامة الوليدة التي كتبها هيستون deacetylation يؤدي إلى انهيار شوكة، وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا. أظهرنا مؤخرا أن تثبيط انتقائي من HDAC1،2 يزيد هيستون أستلة (H4K5ac، H4K12ac وH4K16ac) ويمنع SMARCA5 النشاط لونين remodeler على لونين الناشئ، الذي يرتبط مع انخفاض تطور تكرار مفترق الطرق، وزيادة انهيار شوكة وزيادة تكرار التوتر الناجم عن الحمض النووي من التلف 6 . وبالتالي، يمكن HDAC العلاج المانع يغير هيكل لونين الناشئ لتحريك الحمض النووي من التلف والموت بسرعة كبيرة في خلايا السرطان، حيث أن هذه الخلايا دورة بسرعة وتمرير عدة مرات خلال المرحلة S. ولذلك فمن المهم أن نفهم كيف تعمل HDACs لتنظيم أستلة هيستون والبروتين بيندينانوغرام للحفاظ على تكرار الحمض النووي في خلايا الثدييات. لقياس كمي لمقدار أستلة هيستون وSMARCA5 remodeler ونين المرتبطة الحمض النووي الناشئ خلال تكرار الحمض النووي، ونحن وضعت دعا مقايسة الشذرة تعديل أسلوب BrdU رقاقة فتحة للغرب. بعد مناعي لونين (رقاقة) من المطلوب البروتين أو هيستون تعديل، وكمية من الحمض النووي الناشئ (المسمى باستخدام التناظرية ثيميدين، BrdU) في العينة رقاقة يمكن الكشف عنها باستخدام التحليل الغربي من المسمى BrdU الشذرة DNA نقل على غشاء باستخدام فتحة جهاز لطخة. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن H4K16ac (علامة تشارك في التعبئة والتغليف لونين) وأفراد الأسرة ISWI SMARCA5 (المتعلقة SNF-SWI / المصاحب المصفوفة التي تعتمد على الأكتين منظم من لونين) remodeler ونين ترتبط مع الحمض النووي الناشئ في خلايا S-المرحلة 6. وجدنا أيضا أن العلامة H4K16ac الوليدة وdeacetylated التي كتبها HDAC1،2 خلال تكرار الحمض النووي (6). يمنع H4K16acالنشاط remodeler لونين من أفراد الأسرة ISWI SMARCA5 12. وبالتالي، وذلك باستخدام تقنية BrdU-CHIP فتحة للغرب، فإننا لا يمكن ربط وظائف لHDAC1،2 في تنظيم الكروماتين إعادة عرض خلال تكرار الحمض النووي. وبالتالي، فإن تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب وصمة عار هو طريقة فعالة لقياس كمي لتكوين الجمعيات والتفكك ديناميات البروتينات أو تعديلات في مرحلة ما بعد متعدية التي لا بد أن الحمض النووي الناشئ.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (الغربيين)</td> <td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>الفورمالديهايد</td><td>فيشر</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>بروتين أ الاغاروز</td><td>ميليبور</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>كوكتيل مثبط البروتياز</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG & نب سب.</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>ديوكسي كولات الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>بيكربونات الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>مختبرات</td> <td>الإيثانول</td> ديكون <td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>المياه المعالجة DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>تريس</td><td>فيشر</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>Mallinckrodt GenAR & nbsp ؛</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>الحليب الجاف الخالي من الدسم</td><td>مختبر Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>فيلم الأشعة السينية</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>المطور</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>سونيكاتور</td><td>برانسون سونيفاير&nbsp; نموذج اضطراب الخلايا بالموجات فوق</td> الصوتية <td>الرقمية: 450</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>Eppendorf</td><td>الموديل: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي</td><td>فيشر Scientific Isotemp</td><td>الموديل: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 مقياس الطيف</td> الضوئي <td>ThermoScientific</td><td>نموذج: 1000</td><td></td></tr><tr><td>جهاز لطخة فتحة &nbsp ؛</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة زراعة الأنسجة</td><td>السلسلة العلمية الحرارية</td><td>II 3110 حاضنات</td><td></td> CO2 مغلفة بالماء</tr></tbody></table>

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة dna في خلايا الثدييات عن طريق brdu رقاقة فتحة للغرب تقنية

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

deacetylases هيستون 1 و 2 (HDAC1،2) تعريب لمواقع تكرار الحمض النووي. في الدراسة السابقة، وذلك باستخدام مثبطات انتقائية ونظام ضربة قاضية الجيني، أظهرنا وظائف جديدة لHDAC1،2 في النسخ المتماثل شوكة التقدم والاستقرار لونين الوليدة في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب الذي يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) من برومو-deoxyuridine (BrdU) DNA -labeled مع فتحة لطخة والتحليلات الغربية لقياس كميا البروتينات أو تعديل هيستون المرتبطة الحمض النووي الناشئ. بنشاط تم علاج الخلايا المنقسمة مع HDAC1،2 مثبط انتقائي أو مع transfected الرناوات siRNAs ضد Hdac1 وHDAC2 ثم وصفت DNA تصنيعه حديثا مع bromodeoxyuridine التيميدين التناظرية (BrdU). وقد تم وضع العلامات BrdU في نقطة زمنية عندما لم يكن هناك دورة الخلية القبض كبير أو موت الخلايا المبرمج بسبب فقدان الوظائف HDAC1،2. التالي لتم تنفيذ abeling من الخلايا مع BrdU، مناعي لونين (رقاقة) من علامات أستلة هيستون أو لونين-remodeler مع الاجسام المضادة المحددة. ثم رصدت المسمى BrdU DNA المدخلات وimmunoprecipitated (أو ChIPed) DNA على غشاء باستخدام تقنية فتحة وصمة عار وثبتوا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. ثم تم تقييم كمية الحمض النووي الناشئ في كل فتحة كميا باستخدام التحليل الغربي مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. ثم تم تحديد تأثير فقدان الوظائف HDAC1،2 على مستويات تصنيعه حديثا هيستون علامات أستلة المرتبطة الحمض النووي والكروماتين remodeler عن طريق تطبيع إشارة BrdU رقاقة تم الحصول عليها من العينات المعالجة إلى عينات السيطرة.

لتحديد خصوصية مثبطات HDAC1،2 انتقائية، استخدمت Hdac1،2 FL / FL وHdac3 FL / FL خلايا ليفية. واستخدمت لجنة المساواة العرقية recombinase (الإعلان، لجنة المساواة العرقية) التي تحتوي على اتش حذف Hdac1،2 وHdac3 في هذه الخلايا. بعد الإصابة الإعلان، لجنة المساواة العرقية من Hdac1،2 FL / FL الخلايا، لوحظ وجود زيادة قوية في H4K5ac. لم علاج الخلايا خروج المغلوب...

في هذا البروتوكول ، نصف تقنية BrdU-ChIP-Slot-Western جديدة لفحص البروتينات وتعديلات الهيستون المرتبطة بالحمض النووي المركب حديثا أو الناشئ.

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الناشئ بسرعة بدقة باستخدام وضع العلامات BrdU وترسيب الكروماتين. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في النسخ المتماثل ، والإصلاح في مجال الكروماتين ، مثل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الناشئ أثناء تكرار الحمض النووي وما هي بروتينات الإصلاح المرتبطة بالحمض النووي الناشئ أثناء إجهاد النسخ المتماثل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سريعة نسبيا للكشف عن البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الناشئ بطريقة كمية للغاية.للبدء ، قم بإعداد ثقافات مليوني خلية من المعاهد الوطنية للصحة 3T3 في 10 ملليلتر من الوسائط إما باستخدام DMSO أو مثبطات. أيضا ، أضف BrdU إلى التركيز النهائي البالغ 20 ميكرومولار. بمجرد طلاءها ، احتضن الخلايا لمدة 60 دقيقة.بعد ساعة ، قم بربط البروتينات داخل الخلايا بالحمض النووي عن طريق إضافة الفورمالديهايد مباشرة إلى وسط الثقافة بتركيز 1٪ من حيث الحجم. ثم اترك الخلايا تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع التحريض. بعد 10 دقائق ، قم بإخماد التفاعل عن طريق إضافة الجلايسين إلى الوسائط إلى 125 ملليمولار واستمر في الحضانة لمدة خمس دقائق أخرى.بعد ذلك ، اجمع الخلايا في PBS واغسلها مرتين باستخدام PBS باستخدام الطرد المركزي. يمكن تجميد الحبيبات عند 80 درجة مئوية لكل مخزن إذا رغبت في ذلك. الآن ، قم بإعداد المحللة من الخلايا المتشابكة ، وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FA140 المكمل بكوكتيل مثبط البروتياز إلى الحبيبات وقص الكروماتين باستخدام خمس نبضات مدتها 15 ثانية من الصوتنة.حافظ على تبريد الخلايا بين البضاقات. بعد ذلك ، قم بتشغيل 10 ميكرولترات من العينة على هلام 1.5٪ لتشخيص كفاءة القص. بمجرد قصها ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.ثم قم بتقدير تركيز البروتين في المادة الطافية باستخدام مجموعة. بعد ذلك ، قم بإعداد ملاط بنسبة 50٪ من حبات بروتين أ الاغاروز مع عازلة FA140 تحتوي على مثبط للبروتياز. أضف 50 ميكرولترا من الملاط إلى كل عينة واحتضان العينات عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر من طرف إلى طرف لمدة 30 دقيقة.بعد نصف ساعة ، قم بتدوير العينات لمدة دقيقة حوالي 1000 جيجا في جهاز طرد مركزي مبرد. ثم اجمع المادة المطفية التي تحتوي على الكروماتين المسمى. قبل المتابعة ، احفظ 1/10 من المستخلص عند 20 درجة مئوية ليكون لاحقا بمثابة عنصر تحكم في الإدخال.لترسيب الكروماتين المناعي ، أضف إما ثمانية ميكرولترات من الجسم المضاد H4K16ac أو خمسة ميكروغرامات من الجسم المضاد SMARCA5 للطاف. أضف أيضا خمسة ميكروغرامات من IgG السريع إلى المستخلص الذي يعمل كعينة تحكم سلبية. احتضن الكروماتين عند 4 درجات مئوية طوال الليل على خلاط المشواة.في اليوم التالي ، أضف 50 ميكرولترا من ملاط Agarose المحضر بنسبة 50٪ من البروتين A إلى الترسبات المناعية واحتضان الخلائط لمدة ساعة عند 4 درجات مئوية مع الدوران. بعد ساعة ، قم بتقطيع حبات Agarose وتخلص بعناية من المادة الطافية. الآن ، اغسل الخرزات باستخدام دورات من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية في ثلاثة مخازن متسلسلة.أولا ، استخدم محلول غسيل مركب مناعي طازج وقليل الملح لمدة خمس دقائق. ثانيا ، استخدم محلول غسيل مركب مناعي طازج وعالي الملح لمدة خمس دقائق. ثالثا ، استخدم مخزن غسيل مركب كلوريد الليثيوم المحضر حديثا لمدة خمس دقائق.بعد الغسيل ، أضف محلول الشطف إلى العينات كما هو موضح في النص. قم بتدوير العينات ونقل المصفاة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. الآن ، احتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 5 ساعات لعكس التشابك.في وقت لاحق ، عجل الحمض النووي. أضف ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى العينات واخلطها جيدا. ثم احتضنها عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية.بعد هطول الأمطار ، قم بإزالة الإيثانول باستخدام طرد لمدة 15 دقيقة عند 18000 جيجا. بعد ذلك ، باتباع بروتوكول النص ، اغسل الحبيبات ، وعالج العينات باستخدام RNase ، ثم Proteinase K ، وتنقية الحمض النووي كما هو موضح في النص ، وأخيرا ، قم بتخزينها عند 20 درجة مئوية. للبدء ، قم بقياس عائد المدخلات و ChIP DNA على مقياس الطيف الضوئي.ثم قم بتشويه العينات. أضف 2.5 حجم من 0.4 هيدروكسيد الصوديوم العادي ، ودوامة وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحييد الحمض النووي المشوه عن طريق إضافة 175 ميكرولترا من درجة الحموضة المولية Tris hydochloride 6.8.دوامة ، أجهزة الطرد المركزي ، ووضع العينات على الجليد. الآن ، قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للمدخلات والحمض النووي المرسب المناعي واستمر في اختبار اللطخة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تثبيت الحمض النووي الموجود على اللطخة بالأشعة فوق البنفسجية ، اكتشف BrdU على لطخة الفتحة باستخدام النشاف الغربي.أولا ، قم بسد الغشاء بحليب جاف خالي الدسم بنسبة 5٪ في PBST لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد. بعد ذلك ، قم بإعداد حمام من الحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في PBST مع إضافة 1: 500 من الجسم المضاد المخفف المضاد ل BrdU. احتضن اللطخة في هذا الحمام لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة على شاكر.بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام PBST ثلاث مرات. بعد ذلك ، اغمر اللطخة في تخفيف 1: 5000 من الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP المضاد للفأر في PBST. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع الرج.استخدم ثلاث غسلات مع PBST لإزالة الثانوية وتحليل النتيجة. تم استخدام التقنية الغربية لفتحة BrdU H4K16ac ChIP لتحديد كمية H4K16ac المرتبطة بالحمض النووي الناشئ. لوحظ تخصيب قوي في H4K16ac المرتبط بالحمض النووي الناشئ عند مقارنته بالتحكم السريع في IgG.بعد تثبيط HDAC1 / 2 مع المركب 233 ، لوحظت زيادة في H4K16ac المرتبط بالحمض النووي الناشئ. تم الحصول على نفس النتيجة باستخدام المركب 898. أخيرا ، تم تحديد مستوى إعادة تشكيل الكروماتين SMARCA5 على الحمض النووي الناشئ باستخدام تقنية BrdU SMARCA5 ChIP فتحة الغربية.في الواقع ، لم يغير SMARCA5 المرتبطة بالحمض النووي الناشئ والمركب 898 مستويات SMARCA5. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للتغيرات التي تحدث في الإنزيمات المعدلة للكروماتين والكروماتين أثناء تكرار الحمض النووي في خلايا الثدييات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال النسخ المتماثل لاستكشاف تغيرات الكروماتين في الحمض النووي الناشئ بالإضافة إلى ديناميكيات بروتينات إصلاح الحمض النووي على الحمض النووي الناشئ.في المستقبل ، يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لدراسة ديناميكيات استجابة تلف الحمض النووي وبروتينات إصلاح الحمض النووي في الشوكة المتوقفة بالإضافة إلى دراسة تعديلات الهيستون وإنزيمات تعديل الكروماتين في الشوكة.

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تحديد موقف دورة الخلية من مجموعة من الخلايا ، أو فهم الكيفية التي تؤثر على انتشار الاشارات ، يمكن قياس التدفق الخلوي بسهولة باستخدام هذا البروتوكول. نحن التقرير مقاربة بسيطة التجريبية لخلايا التلوين وقياس موقفهم في دورة الخلية.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

يوصف أسلوب الكمي لتحليل توقيت تكرار كروموسوم. يستخدم الأسلوب BrdU التأسيس بالاشتراك مع...

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

يصف هذا الفيديو بروتوكول تلطيخ التألق المناعي BrdU. تسمح هذه التقنية بتحديد الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. تسمح إضافة أصباغ الحمض النووي ووضع العلامات على الأجسام المضادة بالتحليل التفصيلي لمصير خلايا الطور S في أوقات لاحقة.

تلطيخ التألق المناعي BrdU: تقنية لتحديد الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية

توضح هذه المقالة الفيديو على ميكروأري يستند أسلوب في المختبر لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمدة المنظمين استجابة النظام المكون.

تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة (DAP رقاقة) طريقة لتحديد الأهداف الجيني للبكتيريا نظامان التنظيمية المكون

دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.

التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع

ريبونوكليوتيديس من بين النيوكليوتيدات غير المقبول الأكثر وفرة دمج الجينوم أثناء النسخ المتماثل حقيقية النواة للحمض النووي. إذا تمت إزالة بشكل غير صحيح، يمكن أن يسبب ريبونوكليوتيديس تلف الحمض النووي والطفرات. نقدم هنا، نهجين التجريبية التي تستخدم لتقييم وفرة إدماج ريبونوكليوتيدي في الحمض النووي وآثاره مطفرة.

دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide

في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.

تقييم استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج العالمي باستخدام وسم الحمض النووي BrdU إلى جانب تصوير تمييز دورة الخلية

يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة معدلة للكشف عن الوصلات المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs) وقياسها كميا وتعديلاتها اللاحقة للترجمة (PTMs) ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، و SUMOylation ، و ADP-ribosylation التي تسببها مثبطات توبويزوميراز والفورمالديهايد ، مما يسمح بدراسة تكوين وإصلاح DPCs و PTMs الخاصة بها.

الكشف الكمي عن الروابط المتقاطعة بين الحمض النووي والبروتين وتعديلاتها اللاحقة للترجمة

يقدم البروتوكول التالي الكشف عن بؤر الحمض النووي التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية باستخدام مزامنة دورة الخلية متبوعة بتلطيخ RPA2 المناعي.

تصور بؤر الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية

تم تطوير إثراء وتسلسل الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين (eSPAN) للكشف عن الوفرة النسبية لبروتين مرتبط بالكروماتين على سلسلتين من الحمض النووي المتكاثرين، مما يكشف عن رؤية جزيئية لتكرار الكروماتين وعملياته المترابطة. يصف هذا البروتوكول إجراءات eSPAN في خلايا الجذع الجنينية للخميرة والفئران.

تحليل خاص بالخيوط للبروتينات عند تكرار سلاسل الحمض النووي من خلال إثراء وتسلسل طريقة الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين

غالبا ما تؤدي اضطرابات اعتلال الصفيحة الفقرية إلى تغيرات في الغلاف النووي ، مما قد يسبب الفقاع النووي والتسرب. تقدم هذه الدراسة طريقة التألق المناعي لتصور الصفيحة النووية جنبا إلى جنب مع الحمض النووي مزدوج الشريطة (dsDNA) ، مما يوفر وسيلة لتقييم البنية النووية وسلامتها في خلايا الثدييات.

الكشف عن الفقاع النووي وتسرب الحمض النووي في خلايا الثدييات عن طريق التألق المناعي

اكتشف تقنية BrdU-ChIP-Slot-Western لفحص البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الوليد في خلايا الثدييات. توفر هذه الطريقة الكشف السريع والكمي الدقيق عن تفاعلات البروتينات أثناء تكرار وإصلاح DNA.

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

استكشف المزيد من الفيديوهات