الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو لتقييم EYFP-باركين تجميع كعلامة الخلوية Mitophagy

الهدف العام من مجهر الفيديو بالفاصل الزمني هذا هو تتبع الإزالة الانتقائية للميتوكوندريا التالفة بوساطة بروتين Parkin أثناء عملية الميتوفاجي (البلعمة الذاتية للميتوكوندريا). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التمثيل الغذائي الجزيئي، مثل كيفية تأثير الميتوفاجي على الحالات المرضية المزمنة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر أداة قوية للغاية لتتبع ديناميكيات البروتينات الموصومة أثناء عملياتها الجزيئية.

يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية متعمقة لدورة حياة الميتوكوندريا. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى، مثل مزارع الخلايا الأولية، ودراسات علم الأجنة، والتنبؤ بالأولويات. أما الخلايا الليفية الجنينية للفأر المخلدة المستخدمة في هذه الدراسة، فقد تمت زراعتها في وسط DMEM كامل على طبق زراعة أنسجة بقطر 10 cm عند درجة حرارة 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون.

عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 80%، تخلص من الوسط باستخدام الشفط المعقم وأضف عشرة ملليلترات من PBS المعقم. قم بإزالة PBS، وأضف ملليلتر واحد من Trypsin EDTA بنسبة 0.25%. حضن الطبق عند درجة حرارة 37 °C لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تنفصل الخلايا.

أضف 4 mL من وسط DMEM الكامل، وأعد تعليق الخلايا. خذ 10 µL من معلق الخلايا لعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ازرع 1×10⁶ من الخلايا في طبق زراعة أنسجة بقطر 10 cm، وتحضنها لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وقم بفصل الخلايا عن طريق التريبسين، كما تم توضيحه سابقاً. أضف أربعة ملليلتر من وسط DMEM الكامل، وأعد تعليق الخلايا، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 250 gs ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول PBS المعقم. قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى. تخلص من الطافي بعد عملية الطرد المركزي الثانية.

أضف 100 µL من مزيج المحلول الخاص بالثقب الكهربائي (electroporation) إلى كتلة الخلايا، وأعد تعليق الكتلة بلطف باستخدام الماصة. ثم أضف إلى معلق الخلايا 2 µg من بلازميد التعبير EYFP Parkin و1 µg من بلازميد التعبير DsRed2 Mito. استخدم ماصة باستور ذات الاستخدام الواحد لنقل المحلول إلى كوفت ستيريل (sterile cuvette).

قم بإجراء التثقيب الكهربائي للخلايا باستخدام برنامج محدد مسبقاً. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي، أضف 500 µL من وسط DMEM الكامل الطازج والمدفأ مسبقاً إلى الخلايا، ثم ازرع الخلايا في طبق استنبات أنسجة بقطر ستة سنتيمترات مخصص للتصوير الحي.

حضّن الخلايا في جو رطب يحتوي على خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وقبل البدء بهذا الإجراء، اضبط درجة حرارة غرفة المجهر عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بتحضير وسط تصوير حي متخصص عن طريق خلط المكونات التالية: DMEM خالي من الفينول مضاف إليه عشرة بالمائة من FBS، و2 millimolar per liter من L-Glutamine، و100 units per milliliter من البنسلين، و100 milligrams per milliliter من الستريبتومايسين.

قم بتدفئة الوسط مسبقاً عند 37 °C في حمام مائي. تخلص من وسط الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي باستخدام الشفط العقيم، ثم أضف 1 mL من وسط التصوير الحي المدفأ مسبقاً. قم بتحضين الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

بعد التأكد من استقرار درجة حرارة حجرة المجهر عند 37 درجة مئوية، يتم ضخ ثاني أكسيد الكربون بتركيز 5% في الحجرة. ثم توضع الشريحة التي تحتوي على الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي داخل حجرة المجهر بعناية، ودون القيام بحركات أو اهتزازات كبيرة.

باستخدام واجهة البرنامج، اضبط المجهر للكشف عن الإشارات الفلورية من البروتينات المدمجة التي تشفرها نواقل التعبير EYFP Parkin و DsRed2 Mito. افتح برنامج المجهر الفيديو الزمني. من القائمة العلوية، اختر FITC لـ EYFP Parkin و Rhodamine لـ DsRed2 Mito.

اختر قوة تكبير 20X. باستخدام واجهة البرنامج، ابحث عن خلية واحدة تعبر عن كلا الناقلين اللذين تم نقلهما معاً وسجل موضعها. كرر هذه العملية لما لا يقل عن 10 خلايا لكل حالة تجريبية.

اختر القائمة Apps ثم انقر على Multi Dimensional Acquisition. في نافذة Multi Dimensional Acquisition، حدد المعلمات المطلوبة، مثل عدد مرات الالتقاط، والفاصل الزمني بين كل عملية التقاط، وموضع الخلية المسجلة. انقر على Acquire لبدء الالتقاط الأساسي لكلتا الإشارتين الفلوروسنتيتين.

قم بجمع الصور كل خمس دقائق لمدة إجمالية تصل إلى خمس عشرة دقيقة. وأثناء عملية الحصول على الصور، قم بتحضير وسط تصوير حي مُسخن مسبقاً يحتوي على Carbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone، أو FCCP، بتركيز يعادل ضعف تركيز العمل النهائي. أوقف عملية الحصول على الصور، ثم أضف بلطف 1 mL من وسط التصوير الحي المُسخن مسبقاً والمحتوي على FCCP إلى الطبق الموجود داخل حجرة المجهر.

بعد إضافة FCCP، من المهم إعادة ضبط تركيز المجهر قبل استئناف عملية التقاط الصور. استأنف عملية الالتقاط كما تم وصفه سابقاً، وقم بجمع الصور لمدة إجمالية قدرها ثلاث ساعات باستخدام الموضع المسجل. عند اكتمال عملية التقاط الصور، احفظ جميع الصور التي تم الحصول عليها لتحليلها لاحقاً.

تظهر هنا صور مجهرية بنظام التصوير الزمني لإشارات الفلورة EYFP-Parkin وDsRED2-Mito في الخلايا الليفية قبل إعطاء FCCP. تمثل المربعات البيضاء المناطق المكبرة في اللوحات المقابلة على اليمين. خلال النقاط الزمنية الأساسية، يكون EYFP-Parkin، الذي يظهر باللون الأخضر، منتشرًا بشكل متجانس في جميع أنحاء الخلية.

تبدو شبكة الميتوكوندريا، التي تظهر باللون الأحمر، مترابطة جيداً، كما تشير الأسهم البيضاء. وبعد إعطاء FCCP، يُلاحظ تجزؤ الميتوكوندريا نتيجة لإزالة استقطاب الغشاء عند الدقيقة الخامسة. ومع ذلك، لا يزال EYFP-Parkin منتشراً بشكل متجانس في جميع أنحاء السيتوبلازم.

بعد 55 دقيقة من إعطاء FCCP، يتم استدعاء EYFP-Parkin إلى أغشية الميتوكوندريا التالفة لتحفيز عملية الميتوفاجي (mitophagy). يظهر هذا المقطع الزمني التمثيلي انتقال EYFP-Parkin إلى غشاء الميتوكوندريا بعد إعطاء FCCP. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجارب الالتهام الذاتي لدراسة إعادة تدوير الميتوكوندريا، مما أتاح دراسة عملية الميتوفاجي كآلية لمراقبة جودة الميتوكوندريا داخل الخلايا.