العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا المناعية عن دماغ الفأر الإقفاري لتقديرها الكمي وتوصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد البارامترات. يوفر تحليل التهاب ما بعد الإقفار في الدماغ عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان فهما عميقا للعمليات المناعية المتورطة في تطور الآفة وإصلاحها والنتائج الإجمالية للسكتة الدماغية. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي الطرد المركزي المتدرج السريع ذو الكثافة الواحدة ، والذي يسمح بعزل أعداد كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة من دماغ الفأر الإقفاري.

يستهدف تطبيق هذه التقنية تحديد استراتيجيات العلاج المناعية الجديدة التي يمكن تطبيقها في نافذة زمنية أوسع للسكتة الدماغية والتحقق من صحتها. ابدأ بغمر أحد طرفي أنبوب مضخة التروية التمعجية في HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم المثلج. ثبت إبرة غير حادة عيار 23 في الطرف الآخر من الأنبوب.

وقم بتشغيل المضخة لملء الأنبوب بالكامل باستخدام HBSS. بعد ذلك ، ضع فأر القتل الرحيم ظهريا على لوح تشريح مدمج في صينية بلاستيكية ، وقم بتثبيت الكفوف الأمامية والخلفية ، الممتدة على أوسع نطاق ممكن ، بإبر قياس 20. باستخدام زوج من ملقط الأسنان المستقيم ، واحدا تلو الآخر للإمساك بجلد البطن ، قم بعمل شق جانبي من خلال التكامل وجدار البطن باستخدام مقص القزحية الحاد لكشف الكبد.

ثم ارفع القص ، واستخدم الشفرة الحادة لزوج من مقص القزحية الحاد لشق الحجاب الحاجز. استمر في قطع القفص الصدري الجانبي على كلا الجانبين في الاتجاه الذيلية القحفية ، مع الحرص على عدم إصابة الشرايين الرئوية والقلب والصدر ، واستخدام ملقط حاد ليناسب سديلة الجلد. قم بتثبيت السديلة على لوحة التشريح وافصل القلب بعناية عن النسيج الضام.

أمسك القلب بملقط غير حاد ، ثم أدخل طرف الإبرة قياس 23 في نهاية أنبوب التروية في قمة البطين الأيسر ، مع الحرص على عدم إصابة الحاجز البطيني. باستخدام مقص القزحية الحاد ، قم بشق الأذين الأيمن ، وابدأ تشغيل المضخة على الفور ، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات داخل الضخ. عندما يصبح الكبد لونا فاتحا للقهوة ، استخدم مقصا جراحيا مستقيما لقطع رأس الفأر خلف الجمجمة مباشرة.

ثم استخدم مقص القزحية لعمل شق خط الوسط في فروة الرأس. عندما تكون الجمجمة مرئية ، ضع طرفا واحدا من مقص القزحية الحاد في الثقبة العظمية ، وقم بعمل شق جانبي في العظم. كرر الشق على الجانب الآخر.

ثم استخدم مقص القزحية الحاد للقطع بعناية من نفس التجويف حتى خط الوسط ، باتجاه الأنف. باستخدام ملقط ناعم ، قشر عظام الجمجمة برفق من كل نصف كرة مخية. ثم ارفع الدماغ بملعقة ، واستخدم مقص القزحية الحاد لتشريح الألياف العصبية القحفية التي تثبتها على الجمجمة بعناية.

وضع الدماغ في أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم على الجليد. لفصل الأنسجة الدماغية في معلق خلية واحدة ، استخدم أولا شفرة حلاقة نظيفة لإزالة جذع الدماغ والمخيخ بعناية. ثم استخدم شفرة حلاقة نظيفة أخرى لتقطيع الدماغ ، وقطع كل نصف كرة على طول المستوى الإكليلي إلى ثلاث قطع متساوية الحجم تقريبا.

باستخدام نهاية المكبس لحقنة سعة خمسة ملليلتر ، اهرسي قطع أنسجة المخ من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون ، واشطف المصفاة باستمرار باستخدام HBSS المثلج بالكالسيوم والمغنيسيوم. ثم ضع الأنسجة المتجانسة على الجليد. عندما تتم معالجة جميع العينات ، قم بتدوير معلقات الخلية وتخلص بعناية من المواد الطافية.

أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من عازلة الهضم. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة ملليلتر واحتضان الخلايا تحت دوران مستمر بطيء عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة ، قم بغربلة معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون واشطف الفلتر جيدا بثلاثة ملليلتر من محلول الغسيل الذي يحتوي على DNase.

ثم اغسل المصفاة ب 15 مل من محلول الغسيل الخالي من DNase ، وقم بتدوير الخلايا ، وتخلص من المادة الطافية. لإزالة بقايا الخلية والمايلين ، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ، ووسط تدرج كثافة 25٪ وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. امزج الخلايا في التدرج جيدا مع سحب العينة اللطيف المتكرر.

ثم قم بتدوير محلول الخلية. في نهاية الفصل ، قم بشفط طبقة المايلين والمادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من محلول الغسيل الخالي من DNase. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بتدويرها مرة أخرى ، مع تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.

ثم احسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد التريبان الأزرق ، وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. قبل البدء في التلوين المناعي ، قم باحتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق باستخدام كاشف حجب مستقبلات CD26 / CD32 Fc المضاد للفئران لمنع أي ارتباط غير محدد. ثم أضف الأجسام المضادة الأولية المترافقة بالفلوروفور ذات الأهمية عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في ملليلترين من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي. تدور لأسفل. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، وقم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية حتى تحليل التدفق الخلوي.

لتحديد العدد المطلق للخلايا المناعية المتسللة عن طريق عد الخرز ، قم بعكس 40 ميكرولترا بالضبط من قياس التدفق الخلوي و 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في أنبوب عد يحتوي على عدد معروف من حبات الفلورسنت. بعد ذلك ، قم باحتضان الخلية وتعليق الخرزة بجسم مضاد CD45 المسمى FITC عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام متبوعا بالملء العكسي لأنبوب العد ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي. ثم قم بتشغيل العينة على الفور على مقياس التدفق الخلوي ، وتسجيل الخرزة ، وأحداث الخلية الإيجابية CD45.

بعد 24 ساعة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط ، يمكن التعرف على الكريات البيض التي تتسلل إلى الدماغ من خلال تعبيرها العالي CD45. ضمن عدد السكان المرتفعين CD45 ، يتم تحديد العدلات متعددة الأشكال من خلال تعبير LY-6G بينما تظهر الخلايا الليمفاوية التائية نمطا ظاهريا لسطح الخلية الإيجابي CD45 وإيجابيا ل CD3. يمكن تمييز الخلايا المتبقية التي يبلغ ارتفاعها CD45 من خلال تعبيرها CD19 و CD11b.

بينما يمكن تصنيف الجزء الإيجابي CD11b إلى خلايا وحيدة التهابية عالية Ly-6C ، ومجموعة منخفضة من Ly-6C تشمل الخلايا الوحيدة والضامة والخلايا المتغصنة. في المرحلة الحادة من السكتة الدماغية ، تدخل العدلات الإيجابية Ly-6G إلى الدماغ بسرعة بعد انسداد الأوعية الدموية. على النقيض من ذلك ، تنخفض ترددات الخلايا التائية الإيجابية CD3 في نصف الكرة الإقفارية مقارنة بأدمغة الجراحة الزائفة ونصف الكرة الأرضية المقابل.

ضمن السكان الإيجابيين ل CD11b ، يحول نقص تروية الدماغ التوازن نحو غلبة قوية من الخلايا الوحيدة الالتهابية عالية Ly-6C. علاوة على ذلك ، يزداد إجمالي عدد الكريات البيض في نصف الكرة المخية المحتضب بشكل كبير مقارنة بأدمغة نصف الكرة الأرضية المقابلة والجراحة الزائفة ، بعد 24 ساعة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المناعية عن الدماغ الإقفاري عن طريق التجزئة الميكانيكية ، والهضم الأنزيمي ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، وكيفية توصيف هذه الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن إجمالي إنتاج الخلية يعتمد بشكل حاسم على التفكك الشامل لأنسجة المخ. علاوة على ذلك ، فإن التروية الكافية عبر القلب ضرورية لمنع تلوث الكريات البيض التي تتسلل إلى الدماغ بالخلايا المناعية غير الالتهابية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات التعبير الجيني أو تحليل ملف تعريف السيتوكين لاكتساب رؤى إضافية حول الأهمية الوظيفية للخراج المناعي المتميز في سياق السكتة الدماغية الإقفارية.