العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف وتحديد عدد خلايا الدم المحيطية أحادية النواة التي تسللت إلى البيئة المكروية المبكرة لورم الدماغ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة أورام الدماغ من خلال تحديد العوامل المهمة لتهريب الخلايا المناعية المحيطية إلى البيئة المكروية لورم الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج بيانات كمية تعتمد على الوقت حول عدد وحالة تنشيط الكريات البيض التي دخلت هذا الجهاز العصبي المركزي.

بعد وضع فأر مخدر في إطار تجسيمي ، قم بعمل شق خط الوسط بطول سنتيمترين فوق الجمجمة من العظم الأمامي إلى العظم القذالي باستخدام شفرة مشرط. ثم اسحب الجلد عند الشق باستخدام ضاغطات Collibra. بعد ذلك ، قم بخفض حقنة ميكرولتر مزودة بإبرة قياس 33 فوق BMA مباشرة.

اضبط موضع الإبرة للوصول إلى الموقع المستهدف لزرع الورم. ثم استخدم حقنة توبركولين سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26 لتحديد هذا الموقع عن طريق إخراج السمحاق برفق بعد ذلك. احفر حفرة في الجمجمة في الموقع المستهدف باستخدام مثقاب 0.8 ملم حتى يصل إلى الأم الجافية الأساسية أثناء الحفر.

استخدم ضغطا متقطعا متبوعا بإزالة سريعة لقمة الحفر من سطح الجمجمة لتجنب الحرارة الزائدة والقوة. بعد ذلك ، اغسل حقنة الميكرولتر بكلوريد الصوديوم 0.9٪ في أنبوب دقيق من البولي بروبيلين المخروطي 1.7 مليلتر لضمان عدم انسداد الإبرة. قم بتمرير الأنبوب الصغير المخروطي الشكل المكون من البولي بروبلين سعة 0.6 ملليلتر برفق الذي يحتوي على الخلايا السرطانية عدة مرات لتعليق الخلايا تماما.

ثم اسحب ميكرولترين من الخلايا في حقنة الميكرولتر وتأكد من عدم إدخال فقاعات هواء في المحقنة. قم بتوزيع ميكرولتر واحد من الخلايا على وسادة تحضير كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ ، مع ترك ميكرولتر واحد بالضبط من الخلايا السرطانية في المحقنة. بعد ذلك ، ارفع الإبرة لأسفل حتى تلامس الأم الجافية.

ثم اخفض الإبرة بمقدار 3.5 ملم في الدماغ ، ثم اسحب الإبرة بمقدار 0.5 ملم ببطء وسلاسة. قم بتوصيل الخلايا عن طريق الضغط على مكبس المحقنة على مدار دقيقة إلى دقيقتين. لإجراء نضح القلب العابر على الفأر المخدر بعمق.

أدخل إبرة حادة في البطين الأيسر للقلب. استخدم زوجا صغيرا من مقص التشريح لقص الأذين الأيمن للسماح بإزالة الأذين ، ونظام الدورة الدموية للفأر مع محلول تايرو لعدة دقائق حتى يبيض الكبد والرئتان تماما بسبب نقص الدم. تأكد من عدم استمرار خروج كمية الدم الإجمالية من الأذين الأيمن.

قبل إزالة الإبرة الحادة ذات محور الألومنيوم قياس 20 من البطين الأيسر. بعد إزالة الإبرة ، قم بفك تثبيت الماوس من كتلة رغوة البوليسترين المبثوقة واقلب الجانب البطني للماوس لأسفل. باستخدام مقص تشريح كبير ، افصل الرأس عن باقي الجسم.

ثم قم بقص فروة الرأس على خط الوسط باستخدام زوج صغير من مقص التشريح الذي يعمل من العظم القذالي إلى الخطم لفضح الجمجمة. بعد ذلك ، قم بسحب الجلد على جانبي الجمجمة وأمسك الجمجمة بإحكام. استخدم زوجا من URS العظمي لاختراق الجمجمة بعناية بدءا من العظم القذالي والعمل للأمام لكشف الأسطح الظهرية والجانبية للدماغ تماما.

يكون حصاد دماغ الفأر من الجمجمة دون التسبب في تلفه أمرا صعبا في البداية. قد يرغب أولئك الذين يفتقلون من الخبرة في هذه التقنية في المحاولة عدة مرات قبل إجراء التجارب المناسبة. بمجرد إزالة عظام الجمجمة ، اقلب الجانب البطني لرأس الفأر لأعلى.

قطع الأعصاب القحفية في قاعدة الدماغ لتحريرها من الجمجمة. في هذا الإجراء ، باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ذات حافة واحدة ، قم بعزل منطقة الدماغ التي تحتوي على الورم عن طريق قطع السهمية في مركز الدماغ. لتشريح نصفي الكرة الأرضية ، اقلب الجانب الإنسي لنصف الكرة الأرضية المماثل لأسفل وقم بعمل قطع إكليلي واحد في المخيخ وآخر في البصلة الشمية لعزل الأنسجة المستهدفة التي تحتوي على غرسة الورم.

بعد ذلك ، ضع الأنسجة المستهدفة في مطحنة الأنسجة الزجاجية المسمى التي تحتوي على مليلتر واحد من DPBS. ادفع المكبس لأسفل ولفه سبع مرات لتعطيل الأنسجة. بعد ذلك ، ارفع المكبس للسماح للسائل بالاستقرار مرة أخرى في قاع طاحونة الأنسجة.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ومع ذلك ، قم بلف المكبس أربع مرات فقط خلال التكرارين التاليين وثلاث مرات خلال التكرار الأخير. لتجنب الإفراط في علاج أنسجة المخ.

بعد ذلك ، ضع ثلاثة أحجام سعة مليلتر واحد من DPBS المثلج على جوانب المكبس لشطف مادة الدماغ المتبقية في طاحونة الأنسجة. ثم نقوم بتعليق مادة الدماغ TRID عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ونضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر على الجليد. اشطف جوانب مطحنة الأنسجة السفلية بملليلتر إضافي من DPBS المثلج وأضفه إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 15 ملليلترا.

احتفظ بجميع الأنابيب التي تحتوي على مادة الدماغ TRID على الجليد حتى تتم معالجة جميع العينات. ثم قم بتدوير مادة الدماغ TRID في أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر عند 740 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق مادة الدماغ المحببة في مليلتر واحد من خليط معد مسبقا من إنزيمات الكولاجيناز والحمض النووي واحد الجهاز الهضمي.

ضع أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر في رف أنبوب الاختبار وضع الرف في حمام مائي CS خلية 37 درجة لمدة 15 دقيقة. ثم حرك العينات برفق مرتين طوال فترة الحضانة عن طريق تحريك الأنابيب لتسهيل تفكيك الأنسجة. بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من نائب DPBS البارد إلى كل أنبوب لتخفيف الإنزيمات الهاضمة.

قم بتركيب الأنابيب لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق وتصفية الحجم الكلي من خلال مرشحات شبكية معقمة من النايلون سعة 70 ميكرون في أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 15 ملليلتر على الجليد. بعد ذلك ، قم بتدوير تعليق خلايا الدماغ لأسفل عند 740 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتحقيق حبيبات خلية واحدة. قم بإزالة أنابيب 15 مليلتر من جهاز الطرد المركزي وضعها على الجليد.

ثم قم بزيادة إعداد درجة الحرارة على جهاز الطرد المركزي إلى حوالي 21 درجة مئوية استعدادا للخطوة التالية. بعد ذلك ، قم بإزالة snat الخلية بالكامل وأعد تعليق كريات الخلية في البداية في مليلتر واحد من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ باستخدام ماصة صغيرة P 1000. ثم أضف أربعة ملليلتر إضافي من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ إلى كل أنبوب.

ضع الأغطية بإحكام وقم بتجانس تعليق الخلية عن طريق قلب الأنبوب برفق عدة مرات بعد ذلك ، قم بنقل أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر التي تحتوي على خلايا الدماغ المعلقة بكثافة 70٪. وسائط الطرد المركزي من الجليد إلى رف أنبوب الاختبار في درجة حرارة الغرفة واحدا تلو الآخر. قم بتراكب ملليلترين من محلول وسائط الطرد المركزي بكثافة 37٪ بعناية على خمسة ملليلتر من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ لتشكيل واجهة نظيفة بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة.

ثم ضع علامة على موضع الواجهة بين الطبقتين بعلامة مائلة دقيقة بحيث يمكن التعرف عليها بسهولة بعد الطرد المركزي عندما يصبح التمييز أقل وضوحا. قم بتدوير أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر عند 740 مرة G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع. لتجنب تعطيل الواجهة بين طبقات وسائط الطرد المركزي الكثافة بعد ذلك، قم بتجميع pbmc المتراكمة عند السطح البيني بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة عن طريق إدخال ماصة صغيرة P 200 في الأنبوب.

تجاوز بعناية طبقة الدهون مرة واحدة على مستوى نطاق PBMC ، واستخرج ببطء 200 ميكرولتر من سطح طبقة وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ وقم بنقله إلى أنبوب فاكس بولي بروبلين مسمى على التوالي على الجليد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 400 ميكرولتر لكل عينة. تعد القدرة التجريبية على تشكيل واجهة نظيفة بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة أمرا بالغ الأهمية للعزل القابل للتكرار ل p BMCs.

يجب على المرء أن يصب وسائط الطرد المركزي بكثافة 37٪ ببطء أثناء زاوية الأنبوب من 20 إلى 30 درجة فوق سطح المقعد. يوضح هذا الشكل استراتيجية البوابات لبوابات التجربة النموذجية الموضوعة على GR واحد خلايا نخاعية موجبة CD 11 B الموضحة في الخطوة الخامسة و NK 1.1. ثم يتم تقسيم الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية الموضحة في الخطوة السادسة إلى طبقات بناء على تعبير GZMB في الخطوتين الخامسة الأولية والسادسة الأولية على التوالي.

في هذا الشكل ، تظهر بوابات GR واحدة إيجابية CD 11 B والخلايا النخاعية الإيجابية NK 1.1 على FSCA مقابل SSCA الحجم اللمفاوي الأصغر للخلايا القاتلة الطبيعية مقارنة بالمجموعة النخاعية الأكبر حجما نسبيا ، مما يوفر مزيدا من التأكيد على هوية هاتين المجموعتين الفرعيتين ل pbmc. تظهر البيانات هنا أن نقش GL 26 sital one I خلايا الورم الدبقي في syngen. يحفز دماغ الفأر الأسود XC 57 six J بسرعة على تجنيد أرقام PBMC الإيجابية CD 45 الموضحة بالاقتران مع كل نقطة بيانات على طول منحنى GL 26 sitting GAL one I يمثل تحريض الطية للورم الذي يتسلل إلى pbmc فوق السيطرة.

GGL 26 تجلس أورام NT في الساعة المحددة بعد زرع الورم أو HPI بناء على كوكتيل الأجسام المضادة المحدد المستخدم في العرض التوضيحي GR واحد إيجابي CD 11 B الخلايا النخاعية الإيجابية و NK 1.1 الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية تدخل على وجه التحديد GAL بيئة مكروية للورم ناقصة في غضون 48 ساعة من نقش الورم. ومع ذلك ، فإن العدد الإجمالي للورم الدبقي الذي يتسلل إلى الخلايا النخاعية يفوق بكثير الخلايا القاتلة الطبيعية. بمجرد إتقانها ، يتم تحديد المنهجية من حصاد الدماغ إلى التدفق.

يمكن إجراء التحليل الخلوي في غضون ست ساعات تقريبا بواسطة تجريبي واحد. من الضروري أن يتم تحليل الحجم الكامل لكل عينة PBMC بواسطة مقياس التدفق الخلوي من أجل تحقيق مقارنة عادلة للعدد الإجمالي للتجارب التكميلية للورم الدبقي المتسلل إلى pbmc. يمكن إجراء هذا التحليل الكيميائي المناعي للحصول على بيانات مكانية عن تسلل الخلايا المناعية وللسماح بقياس الحجم الكلي للورم والتشريح الدقيق في نقاط زمنية تتوافق مع تلك التي تم تقييمها باستخدام هذا الإجراء.

يمكن تطبيق هذه التقنية على دراسة نماذج أورام المخ المتنوعة ، بما في ذلك تلك التي تم إنشاؤها من جديد باستخدام الحمض النووي للبلازما المشفر للجين الورمي دون تغييرات كبيرة في الإجراء العام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير معلقات خلايا الورم الدبقي للجسم والطعم في دماغ الفأر ، وكيفية عبور الورم الغزير ، والفئران الحاملة للدماغ ، وكيفية عزل وتدفق السيتو بشكل متري ، وتحليل الورم الدبقي الذي يتسلل إلى خلايا الدم المحيطية أحادية النواة.