بدء التمايز في الخلايا متعددة القدرات مخلد أذني السلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو التفريق بين الخلايا السلفية متعددة القدرات الخالدة إلى أنواع خلايا الأذن الداخلية. لذلك يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في التجديد السمعي ، مثل كيف يمكن أن تصبح أسلاف الأذن خلايا شعر القوقعة الصناعية أو الخلايا العصبية السمعية. الأهم من ذلك ، توفر هذه التقنية نظاما خلويا في المختبر يمكن استخدامه بالتوازي مع أنظمة نماذج الثدييات في الجسم الحي.

سيوضح الإجراء اليوم آزاده جادالي ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري ، بالإضافة إلى Zhichao Song ، و Alejandra Laureano ، وهما طالبان دراسات عليا في المختبر. بعد تحضير وسط الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص ، استخدم ثلاثة ملليلتر من هذا السائل لطبق واحد في عشرة إلى السلف السادس متعدد القدرات الخالد ، أو خلايا IMOP ، في طبق زراعة الأنسجة 60 ملم. احتضان الخلايا لمدة خمسة إلى سبعة أيام عند 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

كل يومين ، ضاعف حجم السائل في المزرعة عن طريق إضافة وسط طازج. لتمرير الخلايا ، قم أولا بنقلها من طبق الثقافة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. ثم ضع الأنبوب، عند 37 درجة مئوية، لمدة خمس إلى عشر دقائق.

خلال هذا الوقت ، توقع أن تتجمع المستعمرة التي تشكل الغلاف الجوي في قاع المخروطي عن طريق ترسيب الجاذبية. بعد ذلك ، استنشق المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزعاج اللوحة. أعد تعليق الغلاف الجوي عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الملح المتوازن المحضر مسبقا ، وهو مليمولار واحد EDTA المعزز أو HBSS ، ثم سحب العينة لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات.

لتسهيل تفكك الغلاف الأذني إلى خلايا مفردة ، ضع المخروطي في حاضنة عند 37 درجة مئوية. قم بتدوير المحلول بشكل دوري وعندما لا يلاحظ وجود غلاف أوتوسفير على شكل رواسب في قاع الأنبوب ، انقله إلى درجة حرارة الغرفة. استمر في إضافة ملليلترين من وسط الثقافة إلى الخلايا لتحييد EDTA.

وقم بطردها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند 200 جرام. ثم استنشق محلول EDTA المخفف واغسل الخلايا في خمسة ملليلتر من 1x PBS. بعد تدوير الخلايا باستخدام نفس الإعدادات ، قم بسحب 1x PBS.

بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من وسط الثقافة إلى المخروطي. وإعادة تعليق لوحة الخلايا. للعد ، قم بتخفيف خلايا IMOP من واحد إلى مائة في وسط الاستزراع.

ثم أضف 75 ميكرولترا من هذا المحلول إلى كاسيت موجود في عداد جسيمات الموائع الدقيقة وحدد رقم الخلية. بعد ذلك ، ضع صفيحة واحدة في عشرة إلى خلايا IMOP السادسة في طبق زراعة أنسجة 60 ملم كما هو موضح سابقا وكرر إجراء المرور هذا كل خمسة إلى سبعة أيام. بعد ثلاثة أيام من الطلاء ، استخدم ترسيب الجاذبية لجمع الغلاف الجوي كما هو موضح سابقا.

تابع لشفط المادة الطافية. وأعد تعليق الخلايا برفق في ملليلترين من وسط التمايز الظهاري الحسي. ثم استخدم ماصة مسام كبيرة سعة عشرة ملليلتر لنقل الغلاف الجوي إلى طبق جديد سعة 60 ملم.

ميز الغلاف الجوي لمدة عشرة أيام. إضافة ملليلترين من وسط التمايز الطازج إلى الثقافة كل يومين. بعد ذلك ، قم بحصاد الغلاف الجوي مرة أخرى من خلال ترسيب الجاذبية.

واستنشاق الوسط المستهلك. بعد ذلك ، قم بإصلاح الغلاف الجوي في أربعة بالمائة من بارافورمالدهيد في 1x PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة محلول الفورمالديهايد واغسل الخلايا في 1x PBS يحتوي على 0.1 في المائة Triton x100.

استمر في حجب الغلاف الجوي في 1x PBS مكملا بنسبة عشرة بالمائة من مصل الماعز و 0.1 في المائة من Triton x100. بعد ساعة واحدة ، استبدل المخزن المؤقت المانع بتلك التي تحتوي على التخفيف المناسب للجسم المضاد Cdkn1b أو CDH1. ثم احتضان الخلايا في الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

وفي اليوم التالي استمر في التلوين المناعي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المصنفة بالفلورسنت ، الفالودين ، و Hoechst ، كما هو موضح في مكان آخر. للتحضير للتصوير ، ضع وسط التثبيت على شريحة زجاجية. ثم أدخل الغلاف الجوي الملطخ في الوسط.

بعد ذلك ، ضع زلة غطاء أعلى العينة. بعد ترك وسط التركيب يجف طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، ضع الشريحة على مسرح المجهر المقلوب المزود بكاميرا CCD 16 بت. باستخدام الهدف الجوي 20x 0.75 ، احصل على صور epifluorescence عن طريق جمع البيانات من القنوات الزرقاء والخضراء والحمراء والأشعة تحت الحمراء.

أولا ، ينزلق الغطاء الزجاجي المستدير النظيف عن طريق وضعه في صفيحة معقمة 100 ملم وغمرها في 70 بالمائة من الإيثانول. حرك زلات الغطاء برفق للتأكد من تغطيتها واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بعد ذلك ، اشطف زلات الغطاء ثلاث مرات في 1x PBS معقم ثم مرة واحدة بالماء المعقم.

ثم اترك الغطاء ينزلق عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. للاستخدام الفوري ، ضع غطاء معقم واحد في كل بئر من لوحة 24 بئرا. وقم بهز اللوحة برفق للتأكد من أن جميع زلات الغطاء مسطحة.

ثم قم بتغطية زلات الغطاء بإضافة 0.25 مل من 1x PBS تحتوي على 10 ميكروجام لكل مليلتر من بولي د ليسين إلى كل بئر. بعد تحضين اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة محلول بولي دي ليسين واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS معقم. بمجرد شفط السائل من آخر غسلة ، أدخل 0.25 مل من 1x PBS يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من Laminin ، في كل بئر من البئر ال 24.

بعد احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، استنشق محلول Laminin ، ثم اغسل كل بئر بمليلتر واحد من 1x PBS ثلاث مرات ، لكن اترك PBS من آخر غسيل في الآبار حتى تصبح الخلايا جاهزة للطلاء. لبدء التمايز العصبي ، عد الخلايا من الغلاف الأذني المنفصل كما هو موضح سابقا. ثم أعد تعليقها في وسط التمايز العصبي الدافئ مسبقا.

استمر في البذر بين نقطة واحدة ونقطة واحدة خمس مرات في عشرة إلى خلايا IMOP الخامسة في كل بئر من اللوحة التي تحتوي على زلات الغطاء المطلي. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. استبدال وسيط التمايز العصبي كل يوم.

بعد سبعة أيام ، قم بشفط الوسط ، وقم بإصلاح الخلايا ، التي يجب ربطها بزلات الغطاء ، عن طريق إضافة أربعة بالمائة من الفورمالديهايد في كل بئر. وتركها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة الفورمالديهايد واغسل الخلايا مرة واحدة في 1x PBS تحتوي على 0.1 بالمائة Triton x100.

بعد ذلك ، قم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت. وأضف المخزن المؤقت المانع الذي يتكون من 1x PBS يحتوي على عشرة بالمائة من مصل الماعز العادي ، و 0.1 في المائة من Triton x100 لكل بئر. اترك الخلايا لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة السائل واستبدله بمخزن مانع يحتوي على التخفيف المناسب للجسم المضاد Cdkn1b أو Tubb3. بعد حضانة ليلية عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS يحتوي على واحد بالمائة Triton x100. ثم تابع تلطيخ المناعة كما هو موضح سابقا.

بعد اكتمال التلوين ، قم بإجراء غسيل نهائي عن طريق إضافة 1x PBS إلى الآبار. لإعدادها للتحليل ، قم بإزالة زلات الغطاء التي يتم ربط الخلايا الملطخة بها من لوحة 24 بئر. ووضعها على وسط التثبيت على شريحة زجاجية.

بعد ترك وسط التركيب يجف طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، احصل على صور epifluorescence كما هو موضح سابقا. تظهر الغلاف الجوي المزروعة لمدة عشرة أيام في وسط التمايز الظهاري زيادة في تعبير Cdkn1b ، وهو مثبط كيناز يعتمد على ركوب الدراجات ، وعلامة لتمايز الأذن الداخلية ، مقارنة بالخلايا غير المتمايزة. هنا لاحظ تلطيخ Hoechst نوى الخلية.

تظهر هذه الخلايا أيضا تغيرات مورفولوجية في خيوط الأكتين ومناطق التصاق الخلية المميزة للظهارة. يشار إليه من خلال ظهور Phalloidin و Cdh1 الملصقات في أطراف الخلية. يمكن أيضا توجيه الغلاف الجوي لتكوين الخلايا العصبية.

تظهر صورة المجال الساطع هذه أنه بعد سبعة أيام في وسط التمايز العصبي ، تظهر خلايا IMOP الخلايا العصبية. التلوين المناعي لهذه الخلايا بعلامة عصبية Tubb3 يؤكد تمايزها. كما أنها تعبر بقوة عن Cdkn1b.

يشير هذا إلى أنه يمكن استخدام إشارة Tubb3 المزدوجة ، Cdkn1b كمؤشر للتمايز العصبي في خلايا IMOP. تم أيضا تطبيع الخلايا المتمايزة وغير المتمايزة Cdkn1b من خلال تحديد نسبتها إلى إشارة Hoechst ، مما يوفر نتائج كمية. يتم عرض الرسوم البيانية لهذه البيانات هنا.

عرض النسب المئوية لخلايا IMOP غير المتمايزة والمتمايزة فوق عتبة محددة مسبقا من Cdkn1b الطبيعي في هذه الرسوم البيانية. يظهر كلا المجموعتين المتمايزتين زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن Cdkn1b مقارنة بالضوابط غير المتمايزة ، مما يؤكد التمايز المقترح بواسطة التألق المناعي. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء الثقافة الروتينية وتمايز خلايا IMOP في 30 دقيقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بدء تمايز خلايا IMOP. شكرا لكم على مشاهدة هذا الفيديو. ونتمنى لك السعادة في تجاربك.