Name: إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: تعلم تقنيات وضع علامات البروتين على الحشرات وكشفها باستخدام ELISA لدراسة انتشارها وهجرتها. هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة تساعد الباحثين على فهم الأنماط البيئية والسلوكية للحشرات في بيئاتها الطبيعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم توفير التمويل من قبل وزارة الزراعة الأميركية كريس 5347-22620-021-00D و، في جزء منه، من قبل الزراعة والأغذية بحوث مبادرة التنافسية منحة لا. 2011-67009-30141 من المعهد الوطني USDA الأغذية والزراعة. ونحن ممتنون للدعم الفني للجوانا ناصيف. كما نشكر بول بيكر، ديفيد هورتون، دييغو نييتو، وفرانسيس Sivakoff لتوفير بعض الصور المستخدمة في الشكل (3).

1. الأقسام الداخلية، الاحتفاظ، والكشف الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء بمناسبة الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100 فرد) من مستعمرة المختبر تربى على النظام الغذائي الاصطناعي أو من الميدان وتقسم إلى حاويتين تربية نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حزمة العادية 20 مل نظام غذائي (لا تحمل علامات علاج المراقبة السلبية) في واحدة من الحاويات. تكملة 20 مل علبة النظام الغذائي الاصطناعي الثانية مع 1.0 مل من 1.0 ملغ / مل الدجاج مفتش / IGY الحل، تخلط جيدا، ووضعه في حاوية أخرى. ملاحظة: إذا لم يكن لدى الحشرة من مصلحة نظام غذائي الاصطناعي، يمكن وضع علامة على أو في أي نظام غذائي مستدام وعادة ما على (على سبيل المثال، والفاصوليا الخضراء والبيض العث والماء والسكر والعسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للحشرات لاستئناف نشاط التغذية لمدة 24 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الداخلية إجراء الاحتفاظ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحزم النظام الغذائي من كل حاوية وتوريد الحشرات ثإيث مصدر الغذاء أخرى للحفاظ عليها خلال مدة التجربة (على سبيل المثال، والفاصوليا الخضراء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لفيف (ن = 20) من الحشرات يوميا (أو في أي الفاصل الزمني المطلوب) من كل معاملة وتجمد على الفور في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطيرة إجراء ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة الدجاج IGY الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 500 في تريس مخزنة المالحة (TBS) إلى كل بئر من ELISA صفيحة ميكروسكوبية نظيفة واحتضان مدة لا تقل عن 1 ساعة على RT (ملاحظة: microplates يمكن أيضا أن تكون المحتضنة O / N عند 4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الضد من لوحة ومنع كل بئر مع 300 ميكرولتر من 1.0٪ الخالي من الدسم حل الحليب الجاف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في انتظار الخطوات الحضانة السابقة، ضع الحشرات المجمدة بشكل فردي في 1.6 مل أنابيب microcentrifuge مع 1.0 مل من TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطحن كل الحشرات مع مدقة نظيفة حتى المتجانس تماما وإضافة 100 ميكرولتر من كل عينة لبئر الفردي للELISAطبق. السماح للعينات لاحتضان في RT لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من سلبية (TBS فقط) وإيجابية (بياض البيض في TBS) ضوابط لالآبار في العمود الأول من كل لوحة ELISA. أيضا، إضافة 100 ميكرولتر من الضوابط الحشرات السلبية (الحشرات لا تحمل علامات) إلى 8 آبار في العمود الأخير من كل لوحة (الشكل 1). السماح للعينات التحكم لاحتضان في RT لمدة 1 ساعة. لاحظ أن النموذج المقدم في الشكل رقم 1 هو القالب نستخدمها لفحوصات موحدة لدينا. وضع العينات في الآبار متروك للسلطة التقديرية للباحث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) -tween ثم إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة الدجاج مفتش / IGY مترافق مع الفجل البيروكسيديز المخفف 1: 10000 في 1٪ محلول الحليب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين وإضافة 50 ميكرولتر من tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، وقراءة الآبارمع معمل صفيحة ميكروسكوبية وضعت في طول موجي 650 نانومتر. </li></ol></li></ol><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي يظهر التسميات جيدا موحدة تستخدم لنموذجي 96 جيدا ELISA صفيحة ميكروسكوبية. كل لوحة تحتوي على 7 آبار مخصصة لضوابط السلبية المالحة تريس مخزنة (TBS)، وهي مخصصة بشكل جيد لعنصر تحكم البروتين الإيجابية (نقاط البيع على Ctrl)، 80 الآبار الفردية المخصصة للحشرات استعادت (نموذج 1 ... 80)، و 8 آبار مخصصة لتحمل أية علامات (السلبية) الضوابط الحشرات (NEG السيطرة 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2. الخارجية مارك، الاحتفاظ، والكشف الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء بمناسبة الخارجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100الأفراد) من مستعمرة المختبر أو من مجال ومكان إلى قسمين 1.0 L حاويات من البلاستيك مع وجود ثقب قطره 2.5 سم لكمات من جانب كل حاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش الحشرات في الحاوية الأولى مع 1.0 مل من درهم 2 O (العلاج السيطرة السلبية) باستخدام البخاخات الطبية. رش الحشرات في الحاويات الثانية مع 1.0 مل من محلول 5.0٪ من بياض البيض والدجاج باستخدام البخاخات الطبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق خرطوم من البخاخات لمنفذ الهواء المختبرات القياسية ثم قم بإدراج الفم من البخاخات إلى 2.5 سم حفرة من الحاوية. ثم، بدوره على منفذ الهواء تدريجيا حتى تنتج البخاخات بخار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة رش (وسم) حتى تم الاستغناء عن حل بياض البيض (حوالي 2-5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البخاخات ووضع الفلين في حفرة من الحاويات البلاستيكية. السماح للحشرات على الوقوف في RT حتى جفت الحل تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الخارجية إجراء الاحتفاظ<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل معاملة الحشرات الجافة في وعاء منفصل تربية نظيفة لتجنب التعرض لمزيد من العلامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الغذاء والماء إلى حاويات نظيفة للحفاظ على الحشرات خلال مدة الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لفيف (ن = 20) من الحشرات من كل معاملة يوميا وتجمد على الفور في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء ELISA غير المباشرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحشرات المجمدة بشكل فردي إلى 1.6 مل أنابيب microcentrifuge وإضافة 1.0 مل من TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع العينات لمدة 1 ساعة على مجموعة شاكر المداري في 120 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عناصر تحكم السلبية والإيجابية كما هو موضح في الخطوة 1.3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النقع، ماصة قسامة 100 ميكرولتر من كل عينة في واحدة من 80 بئرا عينة المعينة على 96 الجديدة جيدا لوحة ELISA كما هو مبين في الشكل 1 السماح للعينات لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT (ملاحظة: في microplates يمكن أيضا أن تكون O المحتضنة / N عند 4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار ثلاث مرات معPBS-توين ثم قم بإضافة 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (PBS-BSA) إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة في RT يغسل مرتين مع PBS-توين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة البيض الأجسام المضادة الأولية الألبومين المخفف 1: 8000 في برنامج تلفزيوني BSA-Silwet (0.05٪) إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين ثم إضافة 50 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب مفتش مترافق مع الفجل البيروكسيديز المخفف 1: 2000 في برنامج تلفزيوني BSA-Silwet (0.05٪) لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين وإضافة 50 ميكرولتر من TMB الركيزة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، وقراءة الآبار مع معمل صفيحة ميكروسكوبية وضعت في طول موجي 650 نانومتر. </li></ol></li></ol> تحليل 3. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب قيمة الامتصاصية متوسط ​​من 8 الحشرات سيطرة سلبية على كل لوحة ELISA ثم حساب الانحراف المعياري استنادا إلى ضوابط السلبية المجمعة جيئة وذهابام كل من لوحات ELISA لدراسة معينة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ست مرات الانحراف المعياري المجمعة إلى الوسط التي تم الحصول عليها عن كل لوحة ELISA للحصول على قيمة العتبة إيجابية ELISA. يعتبر أي عينة الحشرات ذات العوائد قيمة الامتصاصية مساوية أو أكبر من هذه القيمة أن تكون إيجابية لوجود علامة البروتين. </li></ol>

ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا يعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. USDA هو مزود تكافؤ الفرص والعمل.

وقد وصفت الإجراء immunomarking البروتين المفصلية أول ما يقرب من ربع قرن منذ 9. منذ ذلك الحين، تم تكييفها الإجراء لدراسة أنماط تشتت تشكيلة واسعة من المفصليات باستخدام تدار داخليا وخارجيا مفتش / IgYs. وقد أثبتت هذه البروتينات علامات ثابتة لمجموعة واسعة من أنواع الحشرات اختبار حتى الآن. لكن، وكما ذكر أعلاه، فإن القيود الرئيسية لاستخدام مفتش / IgYs هي أنها مكلفة للغاية. ونتيجة لذلك، مفتش / IgYs لا تصلح إلا لMRR ودراسات النوع علامات النفس حيث يمكن أن تكون علامة دفعات كبيرة م...

تتبع حركة الآفات المفصلية، وأعداء الطبيعية (الطفيليات والمفترسات)، والملقحات في الطبيعة أمر ضروري لفهم أفضل لكيفية تحسين خدمات النظام الإيكولوجي. المكون الرئيسي لمعظم أنواع البحوث تشتت هو وجود طريقة يمكن الاعتماد عليها لوضع علامة على المفصلية (ق) من الفائدة. مجموعة متنوعة من المواد (على سبيل المثال، والدهانات والأصباغ والأتربة الملونة، والعلامات، والعناصر النادرة، البروتينات) وقد استخدمت للاحتفال المفصليات لتقييم ديناميات السكان، وتشتيت قدراته، والتغذية والسلوكيات، والتفاعلات البيئية الأخرى 1،2. ومدى ملاءمة علامة تستخدم لتفريق أي بحث معين يتوقف على نوع الدراسة التي تجري. هناك ثلاثة تصنيفات واسعة لوضع علامات المفصليات: (1) علامة الإفراج الاستيلاء (MRR)، (2) علامة التقاط، و (3) علامة التقاط النفس. للبحث علامة الافراج عن الاستيلاء، المحقق عادة يصادف المفصليات جماعي في laboratoراي والنشرات لهم في نقطة مركزية في هذا المجال. ثم استعادت المفصليات في مختلف فترات الزمنية والمكانية باستخدام أجهزة جمع مختلفة (على سبيل المثال، شبكة الاجتياح، فراغ، فخ لزجة) 3،4،5. ثم يتم فحص العينات استعاد لعلامة محددة للتمييز الإفراج عن أفراد الأصلي. للبحث علامة التقاط، المحقق عادة تنطبق علامة مباشرة في مجال استخدام معدات الرش (على سبيل المثال، بخاخ على ظهره، والازدهار وبخاخ فوهة). أفضل علامات للبحوث علامة التقاط غير مكلفة وتطبيقها بسهولة على الموائل والمفصلية ل. للبحث علامة التقاط النفس، المحقق عادة تنطبق علامات إلى الطعم المفصلية 6،7 أو عش مدخل 8. في المقابل، فإن المفصلية يمثل نفسه داخليا من قبل التهام الطعم ملحوظ أو خارجيا من قبل &quot;تنظيف&quot; حتى مقابل المارك فور خروجها من العش. كما ذكر أعلاه، فقد كان لنا العديد من أنواع علاماتإد وضع علامة مجموعة متنوعة من الأنواع المفصلية. ومع ذلك، عدد قليل جدا مفيدة للجميع ثلاثة من هذه الفئات البحوث النثر. وكان التطور الإجراء البروتين immunomarking انجازا كبيرا لوسم الحشرات. Immunomarking يضع تسمية البروتين على المفصليات سواء داخليا أو خارجيا والتي، بدورها، تم الكشف من قبل انزيم مرتبط المناعي فحص محدد لمكافحة البروتين (ELISA). وكانت أول علامات هذا البروتين المناعي تستخدم الأرانب (مفتش) والدجاج مفتش / IGY 9،10. فإنها تبين أن علامات فعالة جدا لMRR والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة). للأسف، والبروتينات مفتش / IGY مكلفة وبالتالي فهي ليست عملية للبحث علامة التقاط ومعظم أنواع البحوث علامة التقاط النفس. وفي وقت لاحق، تم تطوير الجيل الثاني من ELISAs كشف عن البروتين للبروتينات الموجودة في بياض البيض الدجاج (الزلال)، حليب البقر (الكازين) وحليب الصويا (التربسين البروتين المانع). كل فحص حساس جدا ومحددة، وأكثرالأهم من ذلك، يستخدم البروتينات التي هي أقل تكلفة بكثير من البروتينات مفتش / IGY 11. وقد أثبتت هذه البروتينات الفعال لMRR، علامة التقاط، والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة). في هذه المقالة، وصفنا وشرح كيفية إجراء علامة البروتين الدراسات الاحتفاظ المختبر. مثل هذه الدراسات هي المرحلة الأولى من الأبحاث اللازمة لأي نوع من الدراسة تشتت المجال. على وجه التحديد، فمن الأهمية بمكان أن المحققين أعرف كم من الوقت سيتم الاحتفاظ علامة على الأنواع المفصلية المستهدفة قبل الشروع في دراسات تشتت المجال. هنا، وصفنا وشرح كيفية داخليا وخارجيا بمناسبة الحشرات لMRR، علامة التقاط، وعلامة التقاط النفس دراسات نوع الحقل. نحن بعد ذلك شرح كيفية الكشف عن وجود علامات مع ELISAs غير المباشرة وشطيرة.

<table><tbody><tr><td>حاوية تخزين المواد الغذائية (لتربية الحشرات)</td> <td>Rubbermaid / Tupperware</td><td>أحجام مختلفة</td><td>مختلف المصنعين والبائعين. يتم لصق النسيج الشبكي في نافذة</td></tr><tr><td>البخاخات صغيرة الحجم (ضباب صغير)</td> <td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>متوفر عبر الإنترنت وفي متاجر المستلزمات الطبية. ستعمل العلامات التجارية الأخرى أيضا.</td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.6 مل مع غطاء</td><td>منتجات مختبر كونتيننتال</td><td>4445.X</td><td>أي نوع مماثل سيعمل. نحن نفضل العلامات التجارية التي يسهل فتح الأغطية.</td></tr><tr><td>صندوق تخزين الستايروفوم لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة (شبكة 5 × 20) RPI</td> <td>Corp.</td><td>145746</td><td>هذا التصميم جميل لأنه لا يزدحم الأنابيب.</td></tr><tr><td>موزع ، مكرر</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>أي شيء مشابه سيساعد في تسريع الاستغناء.</td></tr><tr><td>المدقة ، مطاحن المناديل البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة ، 1.5 مل</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>متوفرة مع العديد من البائعين. يمكن تنظيف المدقة وتعقيمها لإعادة استخدامها.</td></tr><tr><td>ألواح BD Falcon ELISA ، 96 بئر (قاع مسطح)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>ماصة Ovation ، يدوية (20-200 وميكرو ؛ ل)</td> <td>VistaLab</td><td>1057-0200 أو 1070-0200</td><td>أي نوع مماثل سيعمل. هذا النموذج مريح.</td></tr><tr><td>الخزانات ، الكاشف المعقم</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>أي شيء مشابه سيعمل.</td></tr><tr><td>ماصة إلكترونية ، 8 قنوات (50-1،200 وميكرو ؛ ل) (Biohit eLine)</td> <td>Sartorius</td><td>730391</td><td>إذا كان عليك اختيار نموذج إلكتروني واحد ، فهذا الحجم هو الأكثر فائدة.</td></tr><tr><td>ماصة إلكترونية ، 8 قنوات (10-300 & micro ؛ ل) (Biohit eLine)</td> <td>Sartorius</td><td>730361</td><td>أي شيء مشابه سينجح.</td></tr><tr><td>مشعب ، غسالة لوحة متعددة الآبار (8 أوضاع ، مستقيمة)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>أي شيء مشابه سيعمل مع غسل الألواح يدويا.</td></tr><tr><td>قارئ صفيحة دقيقة مع الكشف عن الامتصاص</td><td>الأجهزة الجزيئية</td><td>SpectraMax 250</td><td>أي شيء مشابه سيعمل.</td></tr><tr><td>دجاج IgG / IgY</td><td>الولايات المتحدة البيولوجية</td><td>I1903-15R</td><td>متوفر أيضا من مصادر أخرى</td></tr><tr><td>متجر بقالة</td> <td>بياض</td> <td>البيض " جميع البيض", " مضارب البيض" ، <م > وما إلى ذلك < / م ></td> <td>امزج 5 مل مع 95 مل من الكثافة العميقة < الفرعية >2 < / فرعية > O لمحلول 5 ٪</td></tr><tr><td>تريس (قاعدة تريزما )</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>T1503</td><td>2.42 جم / لتر لصنع كلوريد</td></tr><tr><td>الصوديوم TBS (كلوريد الصوديوم )</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>S9888</td><td>29.22 جم / لتر لصنع TBS و 8.0 & nbsp ؛ g&#8288;/&#8288; L ل PBS</td></tr><tr><td>ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (Na2HPO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 جم / لتر لفوسفات</td></tr><tr><td>البوتاسيوم أحادي القاعدة PBS (KH2PO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 جم / لتر</td></tr><tr><td>لكلوريد البوتاسيوم PBS (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 جم / لتر ل PBS</td></tr><tr><td>Tween 20 ، درجة</td><td>EIA Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>أضف 0.5 مل لكل لتر إلى PBS بعد إذابة الأملاح.</td></tr><tr><td>PBS مع 1٪ BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>امزج عبوة واحدة في 1 لتر dH2O</td></tr><tr><td>المضاد للدجاج IgY (IgG) (جزيء كامل) أنتج في الأرانب (1: 500)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 & micro ؛ ل في 50 مل ملعقة كبيرة</td></tr><tr><td>حليب جاف أو حليب مجفف أو طازج (1٪)</td>متجر <td>بقالة</td><td></td><td>امزج 10 جم مع 1 لتر dH2O لمحلول 1٪</td></tr><tr><td>أجسام مضادة للدجاج IgY (IgG) (جزيء كامل) - أجسام مضادة للبيروكسيداز المنتجة في الأرانب (1: 10،000)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 & micro ؛ ل في 1 لتر من 1٪ حليب</td></tr><tr><td>مضاد لألبومين بيض الدجاج ينتج في الأرانب (1: 8،000)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>C6534</td><td>تمييع 125 وميكرو ؛ ل في 1 لتر PBS-BSA</td></tr><tr><td>الماعز المضاد للأرانب IgG بيروكسيداز مترافق (1: 2،000)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>A6154</td><td>تمييع 0.5 مل في 1 لتر PBS-BSA ، ثم أضف 1.3 & nbsp ؛ مل Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) سيليكون بوليفور بوليمر</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>أضف كمكون أخير</td></tr><tr><td>TMB Microwell مكون واحد من الركيزة بيروكسيداز</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

وغالبا ما يتطلب مراقبة الحركة المفصلية إلى فهم أفضل لديناميات المرتبطة السكاني وأنماط النثر، وتفضيلات النبات المضيف، والتفاعلات البيئية الأخرى. وعادة ما تعقب المفصليات في الطبيعة عن طريق وضع علامات عليها مع علامة فريدة من نوعها ومن ثم إعادة جمعها عبر الزمان والمكان لتحديد قدرات تشتتهم. بالإضافة إلى علامات المادية الفعلية، مثل الغبار الملون أو الطلاء، وأثبتت أنواع مختلفة من البروتينات فعالة جدا لوسم المفصليات للبحث البيئي. البروتينات يمكن أن تدار داخليا و / أو خارجيا. ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن البروتينات على المفصليات استعادت مع انزيم مرتبط المناعي فحص بروتين معين (ELISA). نحن هنا وصف بروتوكولات للخارجيا وداخليا علامات المفصليات مع البروتين. وأظهرت مثالين تجريبية بسيطة: (1) علامة البروتين الداخلية التي أدخلت على حشرة من خلال توفير نظام غذائي التخصيب من البروتين و (2) علامة البروتين الخارجية موضعيا لpplied لحشرة باستخدام البخاخات الطبية. نحن ثم تتصل دليل خطوة بخطوة من الساندويتش وطرق ELISA غير المباشرة المستخدمة للكشف عن علامات البروتين على الحشرات. في هذه المظاهرة، وتناقش مختلف جوانب اقتناء وكشف عن علامات البروتين على المفصليات للعلامة الافراج عن الاستيلاء، علامة التقاط، وأنواع علامة التقاط النفس من البحوث، جنبا إلى جنب مع مختلف الطرق التي كان الإجراء immunomarking تكييفها لتلائم مجموعة واسعة من أهداف البحث.

الداخلية بمناسبة: وأظهرت نتائج الاختبار الداخلي الاحتفاظ علامة في الشكل 2A. كانت محسوبة ELISA قيمة العتبة الحرجة 0.054. عموما (جميع التواريخ عينة أربعة مجتمعة)، والحشرات علاجها بدون بروتين أسفرت القيم المنخفضة باستمرار ELISA (X = 0.038 ± 0.002، ن = 80). على العكس، كل من الحشرات تتغذى على البروتين المخصب أس...

غالبا ما تستخدم البروتينات لتمييز المفصليات لأبحاث التشتت. يتم توضيح طرق إدارة علامات البروتين الداخلية والخارجية على المفصليات. كما يتم توضيح تقنيات الكشف عن علامات البروتين ، إما من خلال فحوصات الممتز المناعي غير المباشرة أو المرتبطة بإنزيم الساندويتش (ELISAs).

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

الهدف العام من هذا العرض التوضيحي هو وصف كيفية تمييز الحشرات بالبروتين لأبحاث التشتت أو الهجرة. يتضمن هذا العرض التوضيحي طرقا حول كيفية اكتشاف العلامات بواسطة شطيرة أو مقايسة ممتز مناعي غير مباشر مرتبط بالإنزيم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث تشتت الحشرات.يمكن استخدامه لدراسة أنماط هجرة الحشرات ، وتفضيلات النباتات المضيفة للحشرات ، وانتشار الأنواع الغازية. تتمثل مزايا هذه التقنية في أن طريقة الكشف بسيطة وغير مكلفة. مناسبة للإنتاجية العالية ، ويمكن تمييز بسهولة مباشرة في بيئتها الطبيعية.بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأنها تبدو أصعب مما هي عليه ، لأن معظم الباحثين الميدانيين ليس لديهم الخبرة في هذه التقنية البسيطة. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة في عام 1989. كنا نربي المفترسة للحشرات ذات العيون الكبيرة على نظام غذائي اصطناعي.كنا قلقين من أن هذه الحشرات لن تكون مفترسة فعالة على آفة حشرة الليجوس بعد تربيتها في الأسر لفترة طويلة على نظام غذائي غير طبيعي. بمعنى آخر ، سيتم تدجينها. كنا بحاجة إلى طريقة آمنة وفعالة وغير مكلفة لتمييزها بعد إطلاقها في الميدان عن نظرائها الأصليين.لا تتناسب أي من طرق الوسم الحالية مع هذه المعايير. أعطتني تجربة سابقة مررت بها باستخدام إجراء ELISA لإجراء تحليلات محتوى الأمعاء المفترسة لبقايا بروتين Lygus المحددة ، فكرة تطبيق علامة بروتين غريبة على المفترس الذي يتم تربيته في المختبر. في المقابل ، يمكننا تحليل الحقل الذي تم جمعه من الحشرات ذات العيون الكبيرة بحثا عن بقايا Lygus وبقايا البروتين الغريب.للبدء ، اجمع حوالي 100 حشرة ذات أهمية من مستعمرة مختبرية أو من الحقل ، وقسمها إلى حاويتين نظيفتين للتربية قم بتحميل حاوية واحدة بحزمة حمية عادية سعة 20 مليلتر ، لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي. بالنسبة للآخر ، قم بربط علبة حمية مع ملليغرام من الدجاج IgG-IgY.أضف ملليلتر واحد من المحلول واخلطه جيدا. إذا لزم الأمر ، استخدم كل ما يتم إطعامه عادة بدلا من العبوة. بعد 24 ساعة من التربية على عبوات النظام الغذائي هذه ، قم بتزويد كلتا المجموعتين من الحشرات بالطعام العادي غير المميز.في الفترات الزمنية المطلوبة ، اجمع 20 حشرة فردية من كل مجموعة. قم بتجميدها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى يتم جمع جميع الأفواج المطلوبة للتجربة. لتحضير صفيحة 96 بئر ل ELISA ، أضف إلى كل بئر 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي للأرانب IgY المخفف واحدا من كل 500 في محلول ملحي ثلاثي ، أو TBS.دع اللوحة المحملة تحتضن لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في وقت لاحق ، أفرغ الآبار ، وأضف 300 ميكرولتر من محلول الكتلة إلى كل بئر. هذا هو محلول الحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة واحد بالمائة.دع الطبق يحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء حضانة الكتلة ، انقل الحشرات المجمدة الفردية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحملة بملليلتر واحد من TBS. ثم قم بتجانس كل حشرة تماما بمدقة نظيفة.عندما تكون اللوحة جاهزة ، قم بتحميل كل بئر ب 100 ميكرولتر من عينة حشرة متجانسة واحدة. تستوعب كل 96 لوحة بئر 80 عينة. اترك العمود الأول والأخير من اللوحة فارغا لعناصر التحكم.في العمود الأول ، قم بتحميل سبعة 100 ميكرولتر من TBS وحده ، وقم بتحميل بئر واحد ب 100 ميكرولتر من TBS مع التحكم الإيجابي في بياض البيض. في العمود الأخير ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من ثمانية مستحضرات حشرية فردية غير مميزة. اترك العينات تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل.بعد الحضانة ، اغسل الآبار بعناية ثلاث مرات باستخدام Phosphate Buffered Saline Tween ، أو PBS-Tween. من خلال تجربتنا ، تعلمنا أن معظم الأخطاء تحدث أثناء خطوات الغسيل. يمكن أن يؤدي الرش إلى حدوث تفاعلات إيجابية كاذبة بشكل كبير ، لذا كن حذرا.بعد الغسيل ، أضف 50 ميكرولترا من الأرانب المضادة للدجاج IgG-IgY المقترنة ببيروكسيداز الفجل الحار ، وخفف من واحد إلى 10،000 في محلول حليب واحد بالمائة. اترك المحلول يحتضن في الآبار لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. في وقت لاحق ، اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام PBS-Tween كما كان من قبل.ثم قم بتحميل الآبار ب 50 ميكرولتر من ركيزة TMB. قد تبدأ في رؤية تغيير اللون على الفور. دع اللوحة تحتضن لمدة 10 دقائق قبل قراءتها باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري.اقرأ اللوحة عند 650 نانومتر وسجل القيم. لتمييز الحشرات خارجيا ، قم بإعداد زجاجات بلاستيكية سعة لتر واحد مع فتحات وصول ، وقسم 100 حشرة إلى زجاجتين. ثم رش الحشرات في وعاء واحد بملليلتر واحد من الماء المقطر ، والذي يعمل كتحكم سلبي.بعد ذلك ، قم بتوصيل البخاخات الطبية بمخرج الهواء ، واضبط تدفق الهواء بحيث ينتج البخاخات بخارا. رش الحشرات الأخرى بمليلتر واحد من محلول بياض بيض الدجاج بنسبة خمسة بالمائة. يجب أن تستغرق عملية الرش ما بين دقيقتين وخمس دقائق حتى تكتمل.ثم قم بإغلاق الثقوب واترك المحلول يجف تماما في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تجف ، انقل الحشرات مرة أخرى إلى حاويات التربية العادية ، مع نظامها الغذائي القياسي وحافظ عليها كالمعتاد. في وقت لاحق ، اجمع الحشرات على فترات زمنية محددة مسبقا للاختبار.للتحقق من الاحتفاظ بالعلامة الخارجية، استخدم إجراء مطابقا لمزرعة ELISA لاختبار الاحتفاظ بالعلامات الداخلية، مع تعديلات طفيفة. بعد نقل الحشرات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع TBS ، اتركها تنقع على شاكر مداري بسرعة 120 دورة في الدقيقة لمدة ساعة ، بدلا من تجانسها. بعد نقع الحشرات ، قم بوضع 100 ميكرولتر من المحلول في آبار الألواح ، واترك اللوحة تحتضن لمدة ساعة على الأقل.بعد غسل عينات الحشرات ، أضف 300 ميكرولتر من PBS مع واحد بالمائة BSA لكل بئر. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الآبار مرتين باستخدام PBS-Tween. ثم ، أضف إلى كل بئر 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي للأرانب المضاد للبيض ، المخفف واحدا من كل ثمانية آلاف في صورة ظلية PBS-BSA.احتضن الطبق لمدة ساعة على الأقل ، واغسل الآبار كما كان من قبل. ثم ، إلى كل بئر ، أضف 50 ميكرولترا من IgG المضاد للأرانب المقترنة ببيروكسيداز الفجل ، وتخفيفه واحدا من كل ألفين ، في صورة ظلية PBS-BSA. دع اللوحة تحتضن لمدة ساعة على الأقل ، في درجة حرارة الغرفة ثم تابع البروتوكول كما هو موضح سابقا.تم اختبار الاحتفاظ بالعلامة الداخلية في أربع نقاط زمنية. بشكل عام ، أسفرت الحشرات التي تمت معالجتها بدون بروتين عن قيم ELISA منخفضة باستمرار. في حين أن جميع الحشرات التي تغذت على النظام الغذائي الغني بالبروتين أسفرت عن قيم ELISA قوية باستمرار.تم اختبار العلامات الخارجية في أربع نقاط زمنية أيضا. أسفرت الحشرات التي تم تمييزها موضعيا ببياض البيض عن قيم قوية باستمرار. كما هو متوقع ، سجلت الضوابط السلبية التي تم رشها بالماء قيم ELISA منخفضة جدا.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تمييز الحشرات وتحليلها لوجود العلامة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات و 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. على مدار اليوم ، يمكن معالجة 16 لوحة فحص تحتوي على أكثر من 1000 عينة.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الاختبار حساس للغاية. على هذا النحو ، من الضروري أن تكون جميع الأسطح والحاويات والمعدات خالية من تلوث البروتين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف أنماط التشتت المحلية وواسعة المنطقة للحشرات في الموائل الزراعية والحضرية والحرجية وغيرها من الموائل الطبيعية.لقد أظهرنا على مثال صغير الحجم هنا ، ومع ذلك ، فقد تم استخدام هذه التقنية على نطاق أوسع بكثير لتمييز الحشرات مباشرة في بيئتها الطبيعية باستخدام معدات الرش التجارية. لقد اندهشنا من التطبيقات الإبداعية للمتعاونين معنا.

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

JoVE Journal

Environment

البيئة

هذا البروتوكول يوفر إرشادات لاختيار الخط نسيلي الخلية ومقايسة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم لتحليل العلاقات بين الهيكل والنشاط من نيوروببتيد المفصلية توليفها على GPCRs المشابهة لها. ويمكن استخدام هذا الاختبار لمستقبلات deorphanization والدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط التمثيلي للتصميم الصناعي والببتيد / المخدرات يؤدي الاكتشاف.

والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

وهناك طريقة لالمتطايرة بسرعة شاشة محطة المضيفة عن طريق قياس الاستجابة الكهربية من orangeworm السرة الكبار...

Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

يوضح هذا الفيديو تصور تفاعلات البروتين والبروتين في ذبابة الفاكهة  الوصلة العصبية العضلية (NMJ) باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA). بعد عزل جدران الجسم ، يتم فحص البروتينات المتفاعلة مع الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع PLA. يسهل قرب البروتينات المتفاعلة ربط المجسات باستخدام قليل النوكليوتيدات الموصل ، وتشكيل الحمض النووي الدائري ، والذي يتم تضخيمه بعد ذلك عن طريق تضخيم الدائرة المتدحرجة. ترتبط مجسات الفلورسنت بالحمض النووي المضخم ، مما يسمح بتصور تفاعلات البروتين...

الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين في يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام فحص ربط القرب

يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي، وهي جمعية التي سبق تحديدها من خلال المشاركة في مناعي.

الكشف عن في الموقع مجمعات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

ويصف هذا البروتوكول خطوات لاستخدام البرمجيات الرواية، سوارمسايت، لتتبع الإطار حسب الإطار المواقف الهوائي وململه الحشرات من أشرطة الفيديو كاميرا ويب التقليدية باستخدام أجهزة الكمبيوتر التقليدية. البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر عمليات الإطارات حوالي 120 مرات أسرع من البشر وينفذ في أفضل من دقة البشرية.

سوارمسايت: تتبع في الوقت الحقيقي الحركات هوائي الحشرات ومنعكس ملحق ململه باستخدام الإعداد المشترك والأجهزة التقليدية

ونحن نوضح كيفيه تحديد كميه المفصليات السكنية بختم أوراق ونهاية الفروع في كيس ، وقطع وتجميد المواد المعباه ، وشطف المواد المجمدة سابقا في الماء لفصل المفصليات من الركيزة للقياس الكمي.

طريقه لقياس المفصليات المسكنة لأوراق الشجر

يصف البروتوكول الحالي طريقة لجمع ما يكفي من اللعاب من الحشرات المصة للثقب باستخدام وسيلة اصطناعية. هذه طريقة مريحة لجمع لعاب الحشرات ودراسة وظيفة اللعاب على سلوك تغذية الحشرات وانتقال الفيروس المنقول بالنواقل.

اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة اللعاب Laodelphax striatellus

وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.

طريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي لجمع الدملمف من المفصليات الصغيرة

يتم وصف الإجراءات لدراسة سلوكيات الفحص والابتلاع لبعوض Culex tarsalis على أيدي الإنسان باستخدام تخطيط الاختراق الكهربائي AC-DC.

تخطيط الاختراق الكهربائي AC-DC لدراسة سلوكيات الفحص والابتلاع للبعوض الرسغي على أيدي الإنسان

تصف هذه المقالة بروتوكول تقطيع القرص التخيلي الفعال وتلوين الأجسام المضادة الاقتصادي، وهو اقتصادي مع المواد التفاعلية ويسهل التعامل مع الأقراص التخيلية بأعداد قليلة.

تشريح صغير النطاق وتلوين الأجسام المضادة للأقراص التخيلية للعين والجناح من ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر

تعلم تقنيات وضع علامات البروتين على الحشرات وكشفها باستخدام ELISA لدراسة انتشارها وهجرتها. هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة تساعد الباحثين على فهم الأنماط البيئية والسلوكية للحشرات في بيئاتها الطبيعية.

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

استكشف المزيد من الفيديوهات