إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

الهدف العام من هذا العرض التوضيحي هو وصف كيفية تمييز الحشرات بالبروتين لأبحاث التشتت أو الهجرة. يتضمن هذا العرض التوضيحي طرقا حول كيفية اكتشاف العلامات بواسطة شطيرة أو مقايسة ممتز مناعي غير مباشر مرتبط بالإنزيم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث تشتت الحشرات.

يمكن استخدامه لدراسة أنماط هجرة الحشرات ، وتفضيلات النباتات المضيفة للحشرات ، وانتشار الأنواع الغازية. تتمثل مزايا هذه التقنية في أن طريقة الكشف بسيطة وغير مكلفة. مناسبة للإنتاجية العالية ، ويمكن تمييز بسهولة مباشرة في بيئتها الطبيعية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأنها تبدو أصعب مما هي عليه ، لأن معظم الباحثين الميدانيين ليس لديهم الخبرة في هذه التقنية البسيطة. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة في عام 1989. كنا نربي المفترسة للحشرات ذات العيون الكبيرة على نظام غذائي اصطناعي.

كنا قلقين من أن هذه الحشرات لن تكون مفترسة فعالة على آفة حشرة الليجوس بعد تربيتها في الأسر لفترة طويلة على نظام غذائي غير طبيعي. بمعنى آخر ، سيتم تدجينها. كنا بحاجة إلى طريقة آمنة وفعالة وغير مكلفة لتمييزها بعد إطلاقها في الميدان عن نظرائها الأصليين.

لا تتناسب أي من طرق الوسم الحالية مع هذه المعايير. أعطتني تجربة سابقة مررت بها باستخدام إجراء ELISA لإجراء تحليلات محتوى الأمعاء المفترسة لبقايا بروتين Lygus المحددة ، فكرة تطبيق علامة بروتين غريبة على المفترس الذي يتم تربيته في المختبر. في المقابل ، يمكننا تحليل الحقل الذي تم جمعه من الحشرات ذات العيون الكبيرة بحثا عن بقايا Lygus وبقايا البروتين الغريب.

للبدء ، اجمع حوالي 100 حشرة ذات أهمية من مستعمرة مختبرية أو من الحقل ، وقسمها إلى حاويتين نظيفتين للتربية قم بتحميل حاوية واحدة بحزمة حمية عادية سعة 20 مليلتر ، لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي. بالنسبة للآخر ، قم بربط علبة حمية مع ملليغرام من الدجاج IgG-IgY.

أضف ملليلتر واحد من المحلول واخلطه جيدا. إذا لزم الأمر ، استخدم كل ما يتم إطعامه عادة بدلا من العبوة. بعد 24 ساعة من التربية على عبوات النظام الغذائي هذه ، قم بتزويد كلتا المجموعتين من الحشرات بالطعام العادي غير المميز.

في الفترات الزمنية المطلوبة ، اجمع 20 حشرة فردية من كل مجموعة. قم بتجميدها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى يتم جمع جميع الأفواج المطلوبة للتجربة. لتحضير صفيحة 96 بئر ل ELISA ، أضف إلى كل بئر 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي للأرانب IgY المخفف واحدا من كل 500 في محلول ملحي ثلاثي ، أو TBS.

دع اللوحة المحملة تحتضن لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في وقت لاحق ، أفرغ الآبار ، وأضف 300 ميكرولتر من محلول الكتلة إلى كل بئر. هذا هو محلول الحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة واحد بالمائة.

دع الطبق يحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء حضانة الكتلة ، انقل الحشرات المجمدة الفردية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحملة بملليلتر واحد من TBS. ثم قم بتجانس كل حشرة تماما بمدقة نظيفة.

عندما تكون اللوحة جاهزة ، قم بتحميل كل بئر ب 100 ميكرولتر من عينة حشرة متجانسة واحدة. تستوعب كل 96 لوحة بئر 80 عينة. اترك العمود الأول والأخير من اللوحة فارغا لعناصر التحكم.

في العمود الأول ، قم بتحميل سبعة 100 ميكرولتر من TBS وحده ، وقم بتحميل بئر واحد ب 100 ميكرولتر من TBS مع التحكم الإيجابي في بياض البيض. في العمود الأخير ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من ثمانية مستحضرات حشرية فردية غير مميزة. اترك العينات تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل.

بعد الحضانة ، اغسل الآبار بعناية ثلاث مرات باستخدام Phosphate Buffered Saline Tween ، أو PBS-Tween. من خلال تجربتنا ، تعلمنا أن معظم الأخطاء تحدث أثناء خطوات الغسيل. يمكن أن يؤدي الرش إلى حدوث تفاعلات إيجابية كاذبة بشكل كبير ، لذا كن حذرا.

بعد الغسيل ، أضف 50 ميكرولترا من الأرانب المضادة للدجاج IgG-IgY المقترنة ببيروكسيداز الفجل الحار ، وخفف من واحد إلى 10،000 في محلول حليب واحد بالمائة. اترك المحلول يحتضن في الآبار لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. في وقت لاحق ، اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام PBS-Tween كما كان من قبل.

ثم قم بتحميل الآبار ب 50 ميكرولتر من ركيزة TMB. قد تبدأ في رؤية تغيير اللون على الفور. دع اللوحة تحتضن لمدة 10 دقائق قبل قراءتها باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري.

اقرأ اللوحة عند 650 نانومتر وسجل القيم. لتمييز الحشرات خارجيا ، قم بإعداد زجاجات بلاستيكية سعة لتر واحد مع فتحات وصول ، وقسم 100 حشرة إلى زجاجتين. ثم رش الحشرات في وعاء واحد بملليلتر واحد من الماء المقطر ، والذي يعمل كتحكم سلبي.

بعد ذلك ، قم بتوصيل البخاخات الطبية بمخرج الهواء ، واضبط تدفق الهواء بحيث ينتج البخاخات بخارا. رش الحشرات الأخرى بمليلتر واحد من محلول بياض بيض الدجاج بنسبة خمسة بالمائة. يجب أن تستغرق عملية الرش ما بين دقيقتين وخمس دقائق حتى تكتمل.

ثم قم بإغلاق الثقوب واترك المحلول يجف تماما في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تجف ، انقل الحشرات مرة أخرى إلى حاويات التربية العادية ، مع نظامها الغذائي القياسي وحافظ عليها كالمعتاد. في وقت لاحق ، اجمع الحشرات على فترات زمنية محددة مسبقا للاختبار.

للتحقق من الاحتفاظ بالعلامة الخارجية، استخدم إجراء مطابقا لمزرعة ELISA لاختبار الاحتفاظ بالعلامات الداخلية، مع تعديلات طفيفة. بعد نقل الحشرات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع TBS ، اتركها تنقع على شاكر مداري بسرعة 120 دورة في الدقيقة لمدة ساعة ، بدلا من تجانسها. بعد نقع الحشرات ، قم بوضع 100 ميكرولتر من المحلول في آبار الألواح ، واترك اللوحة تحتضن لمدة ساعة على الأقل.

بعد غسل عينات الحشرات ، أضف 300 ميكرولتر من PBS مع واحد بالمائة BSA لكل بئر. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الآبار مرتين باستخدام PBS-Tween. ثم ، أضف إلى كل بئر 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي للأرانب المضاد للبيض ، المخفف واحدا من كل ثمانية آلاف في صورة ظلية PBS-BSA.

احتضن الطبق لمدة ساعة على الأقل ، واغسل الآبار كما كان من قبل. ثم ، إلى كل بئر ، أضف 50 ميكرولترا من IgG المضاد للأرانب المقترنة ببيروكسيداز الفجل ، وتخفيفه واحدا من كل ألفين ، في صورة ظلية PBS-BSA. دع اللوحة تحتضن لمدة ساعة على الأقل ، في درجة حرارة الغرفة ثم تابع البروتوكول كما هو موضح سابقا.

تم اختبار الاحتفاظ بالعلامة الداخلية في أربع نقاط زمنية. بشكل عام ، أسفرت الحشرات التي تمت معالجتها بدون بروتين عن قيم ELISA منخفضة باستمرار. في حين أن جميع الحشرات التي تغذت على النظام الغذائي الغني بالبروتين أسفرت عن قيم ELISA قوية باستمرار.

تم اختبار العلامات الخارجية في أربع نقاط زمنية أيضا. أسفرت الحشرات التي تم تمييزها موضعيا ببياض البيض عن قيم قوية باستمرار. كما هو متوقع ، سجلت الضوابط السلبية التي تم رشها بالماء قيم ELISA منخفضة جدا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تمييز الحشرات وتحليلها لوجود العلامة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات و 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. على مدار اليوم ، يمكن معالجة 16 لوحة فحص تحتوي على أكثر من 1000 عينة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الاختبار حساس للغاية. على هذا النحو ، من الضروري أن تكون جميع الأسطح والحاويات والمعدات خالية من تلوث البروتين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف أنماط التشتت المحلية وواسعة المنطقة للحشرات في الموائل الزراعية والحضرية والحرجية وغيرها من الموائل الطبيعية.

لقد أظهرنا على مثال صغير الحجم هنا ، ومع ذلك ، فقد تم استخدام هذه التقنية على نطاق أوسع بكثير لتمييز الحشرات مباشرة في بيئتها الطبيعية باستخدام معدات الرش التجارية. لقد اندهشنا من التطبيقات الإبداعية للمتعاونين معنا.