الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

الهدف العام من هذا القياس الكمي للأكتين الخيطي في الخلايا العصبية المستنبتة ، هو تقديم طريقة مفيدة لدراسة سلامة وإدراك الهياكل المتشابكة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب حول التنوجين الشوكي واللدونة المشبكية والاستقرار المتشابك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر بروتوكولا مفصلا للثقافة العصبية الأولية ، بعد تحديد النقاط النقطية F-actin وقياسها الكمي.

عندما يكون هدف الإنجاز غير معروف ، من الضروري تقدير السلامة العامة لهياكل الأساس الراتيا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا ندرس تلف الخلايا العصبية الناجم عن تعاطي المخدرات مثل الكوكايين ، والبروتينات السامة لفيروس نقص المناعة البشرية مثل ، تات و JP 120 قبل يومين من إعداد معطف الثقافة 12 ، 35 ملم من الأطباق ذات القاع الزجاجي ، مع ملليلترين من محلول عمل بولي إل ليسين. وقم بتخزين الأطباق في غطاء المحرك طوال الليل للحفاظ على عقمها.

في اليوم التالي ، تخلص من عامل الطلاء ، واشطف الأطباق بالماء المقطر المزدوج. اترك الأطباق تجف لمدة ساعة تحت الغطاء. ثم انقل ملليلترين من وسط الطلاء إلى كل طبق.

واحتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة ثاني أكسيد الكربون. في أحد أيام الثقافة ، ضع الدماغ المحصود في طبق بتري يحتوي على HBSS البارد. بعد ذلك ، قم بتأمين الدماغ بالملاقط ، واستخدم الملقط المنحني لفصل نصفي الكرة الأرضية ، وإزالة السحايا.

اعزل القشرة الأمامية ، وانقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر. أضف ملليلترين من HBSS الطازج ، و 20 ميكرولترا من التربسين EDTA إلى الأنبوب ، واحتضن الأنسجة العصبية لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مع دوامة لطيفة كل بضع دقائق.

في نهاية الحضانة ، استخدم ماصة زجاجية لشفط كل HBSS القديمة. وشطف القشرة مرتين باستخدام HBSS الطازج. بعد الغسيل الثاني ، اغمر الأنسجة في مثبط التربسين.

تخلط جيدا وتترك العينة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل المناديل مرتين باستخدام HBSS الطازج. استخدم الآن ماصة زجاجية مع لمبة مطاطية لترثيب قطع الدماغ ببطء شديد من 10 إلى 15 مرة.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة معايرة مزودة بطرف معقم بقطر منخفض ، قم بتكرار ملاط الأنسجة ببطء شديد مرة أخرى. عندما يكون المحلول متجانسا ، قم بوضع الخلايا بالكثافة المناسبة في أطباق الثقافة المطلية مسبقا لحضانة الليل في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 24 ساعة ، استبدل وسط الطلاء بوسط قاعدي ضيق خال من المصل محضر حديثا.

وإعادة الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 12 إلى 14 يوما على الأقل. الطلاء منخفض الكثافة مهم لتصور الخلايا العصبية الفردية. والوسط القاعدي للخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية في تقليل ثقب النجمة داخل مزارع الخلايا.

لتسمية الخلايا لكيمياء الخلايا المناعية ، اغسل أولا طبق زراعة الخلايا الزجاجي السفلي مرتين باستخدام PBS. ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة أربعة بالمائة بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تليها غسلتان PBS.

بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا بنسبة 0.1 في المائة Triton X 100 في PBS لمدة خمس دقائق ، وقم بتسميتها ببقعة محددة F-actin في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS ومنع أي تلطيخ غير محدد لسطح الخلية بمصل الماعز العادي بنسبة 10٪. في نهاية الحضانة ، قم بتسمية الخلايا الليلية عند أربع درجات مئوية بجسم مضاد متعدد النسيلة للدجاج مضاد للخريطة.

في صباح اليوم التالي ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS وقم بتسميتها بالجسم المضاد الثانوي المناسب. بعد ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، اشطف الخلايا باستخدام PBS مرة أخرى ، وقم بتسميتها ب 10 ميكرولترات من الهكس لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا مرتين أخريتين باستخدام PBS واحتفظ بها ب 100 ميكرولتر من الكائنات المضادة للبهتان.

في غضون ثلاثة أيام من هذا التلوين ، قم بتشغيل المجهر الفلوري وحدد هدف 20 X. بعد ذلك ، في برنامج المجهر ، اضبط حجم صورة البكسل على 1600 × 1200 ودقة الصورة 0.17 ميكرون لكل بكسل إلى 1 × تكبير. انقل طبق الخلايا إلى مرحلة المجهر.

واحصل على صور للخلايا العصبية ذات الخريطة المشتركة F-actin 2 تحت قنوات الفلورسنت الخضراء والحمراء. عندما يتم الحصول على جميع الصور ، اختر خمس صور للخلايا العصبية الفردية في القنوات الخضراء والحمراء والزرقاء مع العرش الشجيرية المحددة بوضوح. واستخدم خريطة مستمرة اثنين من التألق المناعي لتحديد الهياكل الغنية ب F-actin في الأجزاء المتغصنة الثانية المرتبة.

قم بتدوير المنطقة المحددة من الصور أفقيا. وانسخ المنطقة والصقها كصورة جديدة. ثم اطرح تألق خلفية الصورة واستخدم البرنامج لحساب عدد نقاط F-actin الخضراء الزاهية.

استخدم مراقبين مستقلين مدربين لقياس طول الأجزاء المتغصنة المحددة. ثم قم بتصدير أرقام النقاط وبيانات طول المقطع الشجيري إلى ملف جدول بيانات. تأكد من أن المراقبين يشملون نقطة وضعية F-actin مع شدة مضان وردي لا تقل عن 50٪ فوق متوسط شدة التلوين في العمود الشجيري في كل جزء محدد.

أخيرا ، احسب الكثافة وفقا للصيغة ، معبرا عن البيانات على أنها عدد F-actin puncta لكل عشرة ميكرون من التغصنات. هنا ، توضح صور تباين التداخل التفاضلي التغيرات المورفولوجية التي لوحظت في تطوير الخلايا العصبية القشرية للفئران الجنينية في الأيام من 4 إلى 27 في المختبر. لاحظ الزيادة في طول وعدد التشعبات مع نضوج الخلايا العصبية الأولية للفئران المستزرعة.

نظرا لأن وضع العلامات على الفالودين ل F-actin سريع جدا ، فمن الممكن تقدير سلامة الشبكة المتشابكة التغصنية بصريا قبل الشروع في وضع العلامات على الجسم المضاد للخلايا المناعية. Map2 يلطخ التشعبات السليمة ، مما يؤكد أن F-actin puncta تقع على التشعبات العصبية ، وليست موضعية في الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية. في الصور عالية الدقة ، يمكن ملاحظة الهياكل الغنية ب F-actin التي تحتوي على phi filopodia ونتوءات العمود الفقري وبقع F-actin.

في هذه التجربة لتقييم فيروس نقص المناعة البشرية 1 tat تحفز إصابة متشابك متشابك ، كشف تلطيخ Map2 عن عدد أقل من الفروع المتغصنة وتناقص F-actin في الخلايا العصبية القشرية للفئران بعد علاج HIV 1 tat. في الواقع ، يزيد F-actin puncta أو ينقص استجابة للعلاج التجريبي. على سبيل المثال ، في هذه التجربة عندما عولجت الخلايا العصبية المستنبتة بشكل غير تنافسي مضاد لمستقبلات NMDA ، شهدت النقط الإيجابي F-actin زيادة كبيرة في الكثافة.

في المقابل، أدى العلاج بمزيج من الميثامفيتامين بالإضافة إلى فيروس العوز المناعي البشري 1 إلى فقدان كبير لنقط F-actin. بعد الحصول على صور عالية الدقة للخلايا العصبية للفحم المسمى F-actin Map2 ، تذكر أن يقوم مراقبان مدربان باختيار أجزاء من التشعبات الثانية المرتبة لتحليل كثافات النقاط النقطية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث علم الأعصاب.

ليس فقط لمراقبة اعتلال التشابك الحاد ، ولكن أيضا لدراسة الانتعاش المشبكي وعمليات الاستعادة العصبية التجريبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير طريقة موثوقة لقياس السلامة المشبكية للشبكة المتغصنة العصبية.