الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

الهدف العام من عملية قياس كمية نقاط الأكتين الخيطي في العصبونات المستزرعة هو تقديم طريقة مفيدة لدراسة سلامة ومعرفية البنى المشبكية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية حول تكوين الأشواك الشجيرية، واللدونة المشبكية، والاستقرار المشبكي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر بروتوكولاً مفصلاً للاستزراع العصبي الأولي، يليه تحديد وقياس كمية نقاط F-actin.

عندما يكون هدف الإنجاز غير معروف، يصبح من الضروري تقدير السلامة العامة لبنى ratia fundantric. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة أثناء دراستنا للتلف العصبي الناجم عن العقاقير المخدرة مثل الكوكايين، والبروتينات السامة لفيروس HIV مثل tat وJP 120. قبل يومين من إعداد المزرعة، قم بطلاء 12 طبقاً ذات قاع زجاجي بمقاس 35 مليمتر، باستخدام 2 ملليلتر من محلول عمل Poly-L lysine. واحفظ الأطباق داخل خزانة التدفق الصفحي طوال الليل للحفاظ على تعقيمها.

في اليوم التالي، تخلص من عامل الطلاء، واشطف الأطباق بالماء المقطر مرتين. اترك الأطباق لتجف لمدة ساعة واحدة تحت غطاء التدفق الصفحي. بعد ذلك، انقل 2 mL من وسط الزرع إلى كل طبق.

ثم تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. وفي يوم الزرع، يوضع الدماغ الذي تم حصاده في طبق بتري يحتوي على HBSS بارد. بعد ذلك، مع تثبيت الدماغ بملقط، تُستخدم الملاقط المنحنية لفصل نصفَي الكرة المخية وإزالة السحايا.

اعزل القشور الجبهية، وانقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 milliliter. أضف 2 milliliter من محلول HBSS الطازج، و 20 microliters من trypsin EDTA إلى الأنبوب، ثم حضّن الأنسجة العصبية لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع التدوير بلطف كل بضع دقائق.

في نهاية فترة الحضن، استخدم ماصة زجاجية لسحب جميع محلول HBSS القديم. ثم اشطف القشور مرتين باستخدام محلول HBSS جديد. بعد الغسلة الثانية، اغمر النسيج في مثبط التربسين.

امزج جيداً، واترك العينة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأنسجة مرتين باستخدام HBSS طازج. الآن استخدم ماصة زجاجية ذات بصلة مطاطية لترقيق قطع الدماغ ببطء شديد من 10 إلى 15 مرة.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة مُعيرة ومجهزة بطرف معقم ذي قطر منخفض، قم بتجنيس ملاط الأنسجة مرة أخرى ببطء شديد. وعندما يصبح المحلول متجانساً، قم بنثر الخلايا بالكثافة المناسبة في أطباق الزرع المطلية مسبقاً لتركها في الحاضنة الخاصة بزراعة الخلايا طوال الليل. وبعد مرور 24 ساعة، استبدل وسط النثر بوسط أساسي ضيق خالٍ من المصل للنمو الكامل مُحضّر حديثاً.

ثم أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة لا تقل عن 12 إلى 14 يومًا. ويعد استزراع الخلايا بكثافة منخفضة أمرًا مهمًا لرؤية العصبونات الفردية. كما أن الوسط الأساسي للعصبونات ضروري لتقليل تكاثر الخلايا النجمية داخل المزارع الخلوية.

لتوسيم الخلايا من أجل الكيمياء النسيجية المناعية، اغسل أولاً طبق زراعة الخلايا ذو القاع الزجاجي مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بتثبيت الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يليه غسلتان بـ PBS.

بعد ذلك، قم بنفاذية الخلايا باستخدام 0.1% من Triton X 100 في PBS لمدة خمس دقائق، ثم قم بصبغها باستخدام صبغة متخصصة لـ F-actin في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور 20 دقيقة، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS وقم بحجب أي صبغة غير متخصصة على سطح الخلية باستخدام 10% من مصل الماعز الطبيعي. وفي نهاية فترة الحضانة، قم بوسم الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C باستخدام أجسام مضادة متعددة النسائل من الدجاج مضادة لـ map two.

في صباح اليوم التالي، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS وقم بتمييزها باستخدام الجسم المضاد الثانوي المناسب. بعد مرور ساعتين في درجة حرارة الغرفة، اشطف الخلايا بـ PBS مرة أخرى، ثم قم بتمييزها بـ 10 µL من huxs لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين أخيرة باستخدام PBS واحفظها باستخدام 100 µL من كاشف منع التلاشي (anti-fade re-agent).

في غضون ثلاثة أيام من عملية التصبيغ هذه، قم بتشغيل المجهر الفلوري واختر العدسة الشيئية 20 X. بعد ذلك، قم بضبط حجم صورة البكسل في برنامج المجهر على 1600 في 1200، ودقة صورة 0.17 micron لكل بكسل على تكبير 1 X. ثم انقل طبق الخلايا إلى منصة المجهر.

ثم يتم الحصول على صور للخلايا العصبية المصبوغة بـ F-actin وmap 2 باستخدام قناتي الفلورسنت الخضراء والحمراء. وعند الحصول على جميع الصور، يتم اختيار خمس صور لخلايا عصبية فردية في القنوات الخضراء والحمراء والزرقاء ذات التفرعات الشجيرية المحددة بوضوح. ويُستخدم التألق المناعي لـ map 2 المستمر لتحديد الهياكل الغنية بـ F-actin في القطاعات الشجيرية من الدرجة الثانية.

قم بتدوير المنطقة المختارة من الصور أفقيًا، ثم انسخ المنطقة والصقها كصورة جديدة. بعد ذلك، اطرح فلورة خلفية الصورة واستخدم البرنامج لحساب عدد نقاط F-actin الخضراء الساطعة.

استخدم مراقبين مستقلين مدربين لقياس طول قطع الزوائد الشجرية المختارة. ثم قم بتصدير أعداد النقاط وبيانات طول قطع الزوائد الشجرية إلى ملف جدول بيانات. تأكد من أن المراقبين يشملون نقاط وضعية F-actin التي تبلغ شدة فلورستها الوردية 50% على الأقل فوق متوسط شدة الصبغ في ساق الزوائد الشجرية في كل قطعة مختارة.

أخيرًا، احسب الكثافة وفقًا للمعادلة، مع التعبير عن البيانات كعدد من نقاط F-actin لكل عشرة ميكرونات من التغصن الشجري. هنا، توضح صور تباين التداخل التفاضلي التغيرات المورفولوجية الملحوظة في الخلايا العصبية القشرية للجنين الجرذ النامية من اليوم 4 إلى 27 في المختبر. لاحظ الزيادة في طول وعدد التغصنات الشجرية مع نضوج الخلايا العصبية الأولية المستزرعة من الجرذ.

بما أن وسم F-actin باستخدام الفالويدين يتم بسرعة كبيرة، فمن الممكن تقدير سلامة الشبكة المشبكية الشجيرية بصرياً قبل البدء في عملية الوسم بالأجسام المضادة المناعية الخلوية. يقوم Map2 بصبغ التشجرات السليمة، مما يؤكد أن نقاط F-actin تقع على التشجرات العصبية، وليست متمركزة في خلايا أخرى، مثل الخلايا النجمية. ويمكن ملاحظة تراكيب غنية بـ F-actin تحتوي على خيوط phi، وبروزات شوكية، وبقع F-actin في الصور عالية الدقة.

في هذه التجربة لتقييم الإصابة التشابكية الشجرية التي يحفزها HIV 1 tat، كشف صبغ Map2 عن وجود فروع شجرية أقل وانخفاض في F-actin في العصبونات القشرية للجرذان بعد المعالجة بـ HIV 1 tat. وبالفعل، تزداد أو تنقص نقاط F-actin استجابةً للمعالجة التجريبية. فعلى سبيل المثال، في هذه التجربة، عندما عولجت العصبونات المستنبتة بـ memantine، وهو مضاد غير تنافسي لمستقبل NMDA، شهدت النقاط الموجبة لـ F-actin زيادة معنوية في الكثافة.

في المقابل، أدى العلاج بمزيج من الميثامفيتامين وHIV1 tat إلى فقدان ملحوظ في نقاط F-actin. بعد الحصول على صور عالية الدقة للخلايا العصبية Map2 ذات F-actin المصبوغ بـ coal، يجب استعانة مراقبين مدربين لاختيار أجزاء من التغصنات من الدرجة الثانية لتحليل كثافات النقاط. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث العلوم العصبية بعد تطويرها.

لا يقتصر هذا الإجراء على مراقبة الاعتلال المشبكي الحاد فحسب، بل يمتد ليشمل دراسة التعافي المشبكي وعمليات الترميم العصبي التجريبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير طريقة موثوقة لقياس السلامة المشبكية للشبكة الشجيرية العصبية.