في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

الهدف العام من التصوير الحيوي هو تصوير الكالسيوم العابر في الجسم الحي ، وهو وكيل للنشاط ، لفترات أطول ، وفي هياكل الدماغ العميقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل الشكل الذي يبدو عليه النشاط الأساسي لدماغ الذبابة أثناء النوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب الإثارة باستخدام الليزر.

هذا يسمح للمرء بتصوير الكالسيوم العابر بشكل أعمق في الأنسجة ، ولفترة أطول من الوقت دون التبييض الضوئي والسمية ، مقابل تصوير الكالسيوم الكلاسيكي. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لنشاط الدماغ القاعدي في ذبابة الفاكهة ، ويمكن استخدامها أيضا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى ، مثل الفأر. للبدء ، قم بإعداد ذبابة الفاكهة السوداء ، والحلول التجريبية ، كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

بعد ذلك ، يقوم الثلج بتخدير ذبابة الفاكهة واحدة عن طريق نقلها إلى قارورة زجاجية على الجليد لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، انقل الذبابة إلى طبق بتري مبرد ، واستخدم زوجا من الملقط لوضع الذبابة برفق داخل طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر ، مشذب بحيث يكون الطرف بزاوية 35 درجة تقريبا. باستخدام فرشاة ، ادفع كل ذبابة وقم بمحاذاة كل ذبابة برفق بحيث يتجاوز الرأس تماما حافة الحافة ، وتتعرض المنطقة الظهرية جزئيا.

بعد ذلك ، ضع غراء الأسنان المحضر من الرأس إلى حافة طرف الماصة. توخي الحذر الشديد لتجنب تاج الرأس. يعد لصق الرأس أمرا بالغ الأهمية لأن تثبيته في الموضع الصحيح ضروري لنجاح التشريح والتصوير.

بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي اللصق السيئ إلى تسرب محلول الرنين وموت العينة قبل التصوير. بعد ذلك، ضع طرف الماصة، مع الذبابة المرفقة، من خلال الفتحة الموجودة في غرفة التسجيل، واضغط برفق لتثبيتها في مكانها. ثم استخدم غراء السيليكون المحضر لتأمين الجانب المسطح من الغرفة حيث يلتقي بطرف الماصة لمنع أي تسرب.

قم بلصق قطعة من الصنبور على قناة الوفرة ، والحافة القصيرة ، وتمتد إلى الجزء الخلفي من الغرفة. بعد ذلك ، ضع الغرفة مع الذبابة تحت المجهر وقم بتشغيل مصباح الفلورسنت. ثم ، قم بإدخال مرقة واحدة من محلول الجرس في الغرفة.

باستخدام سكين جراحي ناعم ، قم بعمل شقوق متوازية من الجزء الخلفي من رأس الذبابة إلى المنطقة الخلفية على كلا الجانبين. ثم اقطع على طول حافة العين ، وقم بعمل شق عمودي فوق الهوائي الذي يربط الشقوق السابقة. قم بعمل شق نهائي في مؤخرة الرأس ، ثم استخدم زوجا من الملقط الناعم والحاد لإزالة البشرة.

أمسك بلطف وقم بإزالة أي أنسجة تنفسية مكشوفة حتى يتم تصور الدماغ وجسم الفطر الفلوري بوضوح. بعد ذلك ، استخدم ملقطا حادا للغاية لفهم الأنسجة الظهارية العصبية التي تغطي الدماغ بعناية وقرصها لإزالتها والسماح باختراق coelenterazine. باستخدام ماصة، اغسل المنديل مرتين باستخدام مليلتر واحد من محلول الرنين لإزالة أي حطام متبقي من التشريح، ثم ضع العينة في صندوق مظلم.

بعد ذلك ، قم بإدخال ماصة واحدة من محلول الرنين ، الذي يحتوي على خمسة ميكرومولار بنزيل - كولينترازين في الغرفة. أغلق الصندوق واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. ابدأ بتشغيل المجهر في الكمبيوتر.

أيضا ، قم بتبريد الكاميرا إلى سالب 80 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد نظام الصرف واضبط الضوابط البيئية على 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، افتح مصور الفوتون ، وأنشئ مجلدا جديدا ، وقم بتسمية التسجيل الأول.

بعد ذلك ، قم بإعداد نظام الوفرة عن طريق إضافة محلول كلوريد البوتاسيوم والنيكوتين والرنجر إلى الخزانات الخاصة بهم. اضبط التدفق بحيث يتم تفريغ كل محلول بمعدل ملليلتر في الدقيقة. بعد ذلك ، ضع العينة على الحامل تحت المجهر ، واضبط التكبير على 5X.

ثم أدخل أنبوب الوفرة في القناة من خلال الثقب. اضبط المجهر على وضع الفلورسنت ، ثم قم بتوسيط أجسام الفطر وجعلها في بؤرة التركيز. بمجرد أن تصبح أجسام الفطر في بؤرة التركيز ، قم بتغيير التكبير إلى 20X.

أعد توسيط الصورة واضبط التركيز. بعد ذلك ، ضع جهاز الصرف فوق حوض الصرف واضبط ارتفاع تحويلة الصرف ، بحيث يكون الطرف فوق حوض الصرف مباشرة. بعد ذلك ، اغسل العينة بمحلول الرنين لمدة 30 ثانية للتحقق من الصرف الكافي.

أخيرا ، اسحب الدرع لأسفل لإغلاق الجهاز من أي ضوء خارجي. باستخدام النظام الآلي في برنامج تصوير الفوتون ، قم بإجراء تعديلات دقيقة على التركيز ، والتقط صورة فلورية مرجعية لأجسام الفطر. اضبط سرعة الفوتون على سرعة التسجيل المطلوبة ، والتي يجب أن تكون في أي مكان من صورة واحدة كل 50 مللي ثانية إلى صورة واحدة كل ثانية ، أو أكثر.

ثم حدد وضع الفوتون ، وافتح الغالق. بعد ذلك، أدخل النمط الجيني والجنس والعمر ورقم العينة في إدخالات السجل. اضبط موضع مربعات منطقة الاهتمام فوق الكأس وأجسام الخلايا والفصوص الإنسية ، عن طريق النقر على المربعات وسحبها إلى موضعها أثناء الضغط على التحكم.

الآن ، سجل قيم خط الأساس لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، اقلب المفتاح لبدء تدفق النيكوتين. في الوقت نفسه ، اضغط على Enter وأضف ملاحظة للدلالة على أن تدفق النيكوتين قد بدأ.

بعد دقيقة واحدة ، أوقف التدفق ، وقم بتدوين ملاحظة أخرى في السجل تشير إلى توقف التدفق. ثم اغسل العينة بمحلول جرس لمدة خمس دقائق. أثناء تعافي العينة ، قم بإيقاف تشغيل الغسيل ، واضبط المؤقت لمدة خمس دقائق إضافية ، واستعد لبدء تدفق كلوريد البوتاسيوم.

عندما تكون جاهزا للبدء ، ابدأ تدفق كلوريد البوتاسيوم ، وأدخل 100 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم "في سجل العينة. بعد دقيقة واحدة ، أوقف التدفق ، وأدخل إغلاق كلوريد البوتاسيوم "في سجل العينة. ثم اغسل العينة بمحلول الرنين لمدة دقيقة واحدة وقم بتبديل المجهر إلى وضع الفلورسنت.

التقط صورة فلورية نهائية ، ثم قم بإيقاف تشغيل محلول الرنين وإزالة العينة. في برنامج التحليل ، افتح الملف الأول ، وحدد علامة التبويب "التحكم في العرض" ، وانقر فوق عائد الاستثمار. بعد ذلك، اضغط مع الاستمرار على التحكم وحدد منطقة الاهتمام.

بعد ذلك ، اضبط حجم واتجاه وشكل عائد الاستثمار ليشمل الكأس المضيء GFP وأجسام الخلايا والفصوص الإنسية. بمجرد إضافة جميع مناطق الاهتمام ، حدد علامة التبويب "الفيلم" لتشغيل فيديو الفوتون. اضبط العرض الثاني والخطوات الثانية حسب الرغبة.

ثم أعد ضبط موضع عائد الاستثمار حسب الضرورة، بحيث يظل ضمن المناطق النشطة في الفيديو. حدد بعض لقطات الشاشة التمثيلية لمضان GFP ، واستجابة النيكوتين ، واستجابة كلوريد البوتاسيوم. ثم قم بقص لقطات الشاشة والصق الصور التمثيلية في شريحة عرض تقديمي للتحليل والمقارنة المتأخرة.

اضبط كل من العرض الثاني والخطوة الثانية على سرعة التسجيل في ثوان. حدد أيضا طول التحليل عن طريق تحريك العلامات الرمادية في اللوحة العلوية إلى المنطقة الموضوعة بين قوسين، قبل بدء التحفيز، وبعد نهاية الاستجابة مباشرة. بعد ذلك ، حدد تعليق المشاهدات "أثناء التشغيل" ، ثم اضغط على زر الترجيع لإعادة تشغيل الفيديو إلى البداية ، متبوعا بزر التشغيل.

ثم حدد مخطط معدل عدد علامات التبويب "من أجل ضبط الوحدات وكذلك ضبط لون مناطق الاهتمام ، وكذلك ألوان الخط حسب الرغبة. عند انتهاء التحليل، حدد بيانات معدل عدد التصدير. بعد ذلك ، حدد التسجيلات المجمعة للكأس وأجسام الخلايا ، بالإضافة إلى تلك الموجودة في مناطق الفص الإنسي على كل جانب والصق تلك الصور في شريحة مع صور الاستجابة.

واحدة من أبسط الطرق لتحفيز أجسام الفطر من خلال تنشيط مستقبلات أستيل النيكوتين النيكوتين الأيونوتروبيك. تبدأ الاستجابة النموذجية ل 25 ميكرومولار من النيكوتين ، كما هو موضح هنا ، بالتنشيط السريع لكل من أجسام الكأس والخلايا ، والفصوص الإنسية ، وتستخدم بنية GFP-aequorin المنصهرة ، والتي ترتبط بالكالسيوم وتنبعث منها الضوء. بشكل عام ، تستمر الاستجابة في أجسام الكأس والخلايا لفترة أطول ، وتظهر استجابة إضاءة حيوية أكبر من الفصوص ، كما هو موضح في اللوحات المتسلسلة للاستجابة.

يتم وصف عينة تسجيل لاستجابة الإضاءة الحيوية لتنشيط النيكوتين بمرور الوقت بواسطة هذا الرسم البياني ، حيث يتم رسم عدد الفوتونات في المنطقة ذات الاهتمام التي تحتوي على أجسام الكأس والخلايا باللون الأسود ، ويظهر عدد الفوتونات داخل منطقة الفص الإنسي باللون الأحمر. من هذا الرسم البياني ، يمكن تحديد طول الاستجابة ، وقيمة الفوتون القصوى أثناء الاستجابة ، والمساحة الإجمالية تحت كل منحنى. بمجرد إتقانها ، يجب أن تستغرق مرحلة التحضير ساعتين فقط قبل الحضانة ، اعتمادا على عدد الذباب.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إكمال كل تسجيل في أقل من عشرين دقيقة ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التقدم في العمر بشكل صحيح والاحتفاظ بمخزون الذباب لضمان قابلية التكاثر بين العينات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء المزيد من الاختبارات السلوكية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما يؤثر على نشاط الهيكل على سلوك معين.

تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف النشاط العصبي طويل الأمد في ذبابة الفاكهة الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات للتصوير الحيوي في دماغ الذبابة. لا تنس أن النيكوتين يمكن أن يكون خطيرا على صحتك.

يجب اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات عند تحضير المحاليل أو التنظيف من هذا الإجراء.