قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في نبات الأرابيدوبسيس جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

الهدف العام من هذا الإعداد المقطع العرضي التشريحي هو تحديد التراكم النسبي للبلورات والسليلوز عند الدقة الخلوية مما يتيح إجراء مقارنات مباشرة بين الأنسجة المختلفة في جذر نبات الأرابيدوبسيس الأولي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا النبات وتطوره مثل كيفية تأثير التركيب الخلوي لنوع خلية معين على نمو الأعضاء بأكملها. بعد تعقيم بذور نبات الأرابيدوبسيس وفقا لبروتوكول النص ، انشر البذور المعقمة على أطباق تحتوي على 0.8٪ أجار نبات و 0.5XM متوسط.

باستخدام البارافيلم ، لف الألواح وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة يوم إلى أربعة أيام لتعزيز الإنبات المنتظم. ثم انقل الألواح إلى غرفة نمو مناسبة لزراعة شتلات نبات الأرابيدوبسيس ، وتوجيه الألواح عموديا للحفاظ على نمو الجذور فوق وسط الأجار تحضير محلول ريتشاردسون وفقا لبروتوكول النص قم بالتصفية من خلال وحدة مرشح PVD تعمل بالحقنة 0.22 ميكرون قبل الاستخدام.

بعد ذلك ، تحت غطاء كيميائي ، قم بإعداد 50 مل من المثبت عن طريق الجمع بين 38 مل من كاكوديلات الصوديوم 0.5 متر مع 2.5 مل من الجلوتارالديهايد. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول ريتشاردسون إلى محلول التثبيت لتوليد محلول التثبيت النهائي. استخدم لوحا محددا مسبقا ، ثم ضع 2 إلى 3 مل من محلول التثبيت النهائي في الآبار حتى يغطي المحلول الشتلات بالكامل.

باستخدام ملقط بلاستيكي ، انقل بعناية ما يصل إلى 10 شتلات إلى كل بئر. استخدم البارافيلم لإغلاق الألواح قبل تخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة ليلة واحدة على الأقل وحتى أسبوع واحد. لتجفيف الشتلات الثابتة ، استخدم الملقط لالتقاط النباتات عن طريق نقلها إلى آبار ستة ألواح آبار جديدة تحمل علامة تحتوي على تركيزات متزايدة من الإيثانول للأوقات المذكورة هنا.

قم بإعداد وسيط التسلل في زجاجة زجاجية صغيرة عن طريق خلط محتويات كيس واحد من Historesin Activator مع 50 مل من سائل الراتنج الأساسي. أدخل مغناطيسا وحرك المحلول على طبق التقليب لمدة 20 دقيقة. املأ الآبار الملصقة من صفيحة من ستة آبار ب 2 إلى 3 مل من وسط التسلل.

ثم عندما تجف الشتلات تماما ، استخدم ملقطا لنقلها من محلول الإيثانول بنسبة 95٪ إلى وسط التسلل ، مما يضمن تغطيتها بالكامل بالوسط. قم بتخزين العينات على حرارة 4 درجات مئوية لمدة أربعة أيام على الأقل لضمان أقصى قدر من الاختراق في الأنسجة النباتية. لتحضير الكتل ، ضع ملصقات صغيرة بعلامة على اسم العينة داخل كل قوالب تضمين البئر.

قم بإعداد وسيط التضمين بإضافة 1 مل من المقسى إلى 15 مل من وسط التسلل. مع حوالي 200 ميكرولتر من وسط التضمين ، املأ نصف كل بئر في القالب. واستخدم قطعة علوية من الفيلم لتغطية القالب ب 1 مل إضافي على كل جانب.

احتضان القوالب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل للسماح بالبلمرة الجزئية. بعد ذلك ، قم بإعداد دفعة إضافية من وسيط التضمين واحتفظ بها على نار هادئة لتجنب البلمرة أثناء ترتيب أطراف الجذر في القالب. أضف وسط التضمين في طبق صغير وضع شتلة واحدة في وسط.

تحت نطاق التشريح ، استخدم مشرطا لقطع كل طرف جذر ، ثم ضعه بحذر شديد في القالب على بعد حوالي 2 إلى 3 مم من محيط القالب ، إما عموديا لأقسام النقل أو أفقيا للأقسام الطولية. بعد ترتيب الأنسجة ، استخدم وسيط التضمين لملء القالب بالكامل ، وقم بتغطيته بغشاء علوي. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل لتجفيف الكتل ، ضعها في مجفف مع هلام السيليكا الجاف واتركها في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

باستخدام صانع سكاكين مزود بأداة تسجيل الماس ، قم بإعداد سكاكين زجاجية من قضبان زجاجية ، عن طريق قطع الطريق الزجاجي إلى مربع ثم قطع المربع قطريا لإنتاج سكاكين. تحقق من أن كلا السكاكين لهما حواف حادة. قم بتركيب كتلة في حامل.

ثم باستخدام شفرة صناعية ذات حافة واحدة ، قم بإزالة مادة الكتلة الزائدة حتى مم واحد من طرف الجذر للحصول على شكل هرمي. قسم الكتلة المشكلة إلى شرائح بعرض 2 إلى 3 ميكرون وانقل الشرائح إلى شريحة زجاجية مميزة. ثم أضف قطرات الماء على الشرائح.

من المهم إعداد أقسام موحدة في العرض لتقليل تباين البيانات التي تم تحليلها. ضع الشرائح الزجاجية على كتل الحرارة المضبوطة على درجة حرارة منخفضة حتى يتبخر الماء. لتحضير الشرائح للعرض تحت المجهر المستقطب ، قم بتخفيف محلول ريتشاردسون إلى 2٪ من المحلول الأصلي واستخدم حوالي 1 مل لتغطية الشرائح.

ثم ضع العينات على الكتلة الحرارية لمدة 5 ثوان واستخدم الماء المقطر لغسلها. بعد تجفيف الشرائح الموجودة على اللوحة الساخنة ، راقب الشرائح تحت مجهر تشريح واستخدم علامة لتمييز الجزء الخلفي من الشريحة للإشارة إلى موضع الشرائح ذات الأهمية. أضف 100 ميكرولتر من وسط التركيب قبل تغطيتها بقلة الغطاء.

التصوير والتحليل وفقا لبروتوكول النص. يظهر هنا مقطع عرضي للجذر الأساسي لأرابيدوبسيس مع تنظيم شعاعي للخلايا والأنسجة المكونة له بما في ذلك الخلايا غير الشعرية وخلايا الشعر والقشرة. تظهر هذه الصورة متحدة البؤر تعبير BRI1-GFP في الخلايا غير الشعرية في خلفية متحولة BRI1 مما يمنع التمدد أحادي الاتجاه للخلايا المجاورة ونمو الجذر الكامل.

كما هو موضح هنا ، أظهرت المقاطع الطولية للجذور التي تم الحصول عليها من النوع البري ومن الخطوط التي تعبر عن BRI1 في الخلايا غير الشعرية اتجاها مشابها للألياف الدقيقة السليلوز مع تباين كبير في الزوايا الموجودة في الخلايا الإنشائية مقارنة بالخلايا الموجودة في المنطقة الانتقالية. يتيح ذلك مقارنة التراكم النسبي للبلورات في السليلوز في الخلايا الإنشائية والممدودة المقابلة للخلفيتين الوراثيتين كما هو موضح هنا في المقاطع العرضية ويكشف عن وجود علاقة بين تعبير BRI1 في الخلايا غير الشعرية والتراكم الموضعي العالي للبلورات في السليلوز. بشكل عام ، في مقاطع الفيديو الجديدة على هذه الطريقة سوف تكافح لأنه من الصعب الحصول على جذور موجهة جيدا أثناء إجراء التضمين.

لذلك ، يجب إعداد عدة كتل للتقسيم. بمجرد إتقان ، يمكن عمل قسم كتلة واحدة في غضون 2 إلى 3 ساعات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تراكم البلورات في السليلوز يمكن مقارنته بين الخلايا إذا كان لها اتجاه مماثل لأليفائها الدقيقة السليلوز ، على النحو الذي تحدده المقاطع الطولية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصلاح شتلات نبات الأرابيدوبسيس وكيفية تضمينها في كتل وكيفية تحضير مقاطع عرضية طولية وعرضية للجذور. يجب أن يكون لديك أيضا نظرة ثاقبة للبيانات التي يمكن الحصول عليها من استخدام الفحص المجهري الضوئي المستقطب.