في الموقع توصيف المطفأ البروتينات في المياه التي SALVI وTOF-سيمز

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف أغشية البروتين الممتصة في المحاليل المائية ، باستخدام نظام التحليل في واجهة الفراغ السائل ، ومطياف الكتلة الأيونية الثانوية في وقت الرحلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الجزيئات الحيوية والواجهة الحيوية. على سبيل المثال ، توصيف البروتينات الممتصة على سطح صلب.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن بدء الجزيئات الحيوية في الموقع في البيئة السائلة ، وبالاشتراك مع رسم الخرائط الجزيئية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للجزيئات الحيوية في الواجهة الصلبة والسائلة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، بما في ذلك التحقيق في الخلايا السرطانية المفردة ، والتفاعلات الدوائية ، وربط الأغشية الحيوية. في حقنة خمسة ملليلتر ، ارسم ملليلترين من محلول الإيثانول بنسبة 70٪.

قم بتوصيل المحقنة بطرف مدخل جهاز SALVI ، وقم بحقن مليلتر واحد من السائل ببطء على مدار 10 دقائق. في نهاية الحقن ، قم بإزالة المحقنة ، وقم بتوصيل مدخل ومخرج SALVI باستخدام اتحاد البولي إيثر والأثير والكيتون. احتفظ بقناة SALVI الدقيقة مملوءة بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.

ثم املأ حقنة ثانية بالماء معقم منزوع الأيونات. قم بتوصيله بمدخل SALVI وحقن الماء منزوع الأيونات ببطء في الجهاز على مدار 10 دقائق. قم بإزالة المحقنة وأعد توصيل مدخل ومخرج الجهاز معا.

من أجل تثبيت طبقة البروتين ، ابدأ بسحب ملليلترين من محلول الفيبرونيكتين في حقنة. قم بتوصيل المحقنة بمدخل جهاز SALVI ، وقم بحقن ملليلتر واحد من السائل ببطء على مدار 10 دقائق. ثم قم بإزالة المحقنة ، وأعد توصيل المدخل والمخرج مرة أخرى.

احتضن الإعداد في طبق ثقافة نظيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة. بعد الحضانة ، قم بحقن مليلتر واحد من الماء المعقم منزوع الأيونات ببطء على مدار 10 دقائق ، ثم أعد توصيل المدخل بالمخرج. للبدء ، ضع مرحلة ToF-SIMS على سطح مستو ونظيف.

ضع جهاز SALVI على المسرح مع توجيه رقاقة السيليكون وغشاء نيتريد السيليكون لأعلى. قم بتثبيت جهاز SALVI على المسرح باستخدام أربع قطع تثبيت معدنية ، وقم بربط القطع المعدنية التي تمسك زاوية الجهاز في الصفيحة المعدنية بأربعة براغي. بعد ذلك ، قم بلف أنبوب PFTE المتصل بقناة الموائع الدقيقة برفق.

استخدم أربع قطع معدنية وأربعة براغي لتثبيت الجزء الصلب لأسفل. تأكد من وضع الجهاز في المساحة المفتوحة على المسرح ، بحيث لا يتداخل مع شعاع الأيونات الأساسي أثناء التحليل. بعد ذلك ، قم بتركيب كوب فاراداي على المسرح باستخدام المسمار.

بعد ذلك ، افتح باب قفل ToF-SIMS واضبط المسرح أفقيا على منصة التحميل قبل إغلاق الباب. قم بتشغيل مضخة التفريغ واترك غرفة قفل التحميل تضخ إلى حوالي 10 إلى ناقص ستة مليبار. بعد ذلك ، انقل جهاز SALVI إلى الغرفة الرئيسية بعد حوالي 30 دقيقة ، بمجرد استقرار الفراغ.

اضبط شعاع الأيونات الأولي ، ومحلل ToF-SIMS ، للحصول على دقة مكانية تبلغ حوالي 400 نانومتر باتباع البروتوكول الموصى به من قبل الشركة المصنعة. بعد ذلك ، أوجد قناة الموائع الدقيقة باستخدام المجهر البصري. استخدم مركز الصورة البصري كمرجع ، وقم بمحاذاة ليكون متسقا مع مركز الصورة الأيونية الثانوية.

العرض المرئي لهذه الخطوة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلمه ، لأن العينة أكثر سمكا من العينات الصلبة العادية ، ومن الصعب ضبط الإعدادات للعثور على أفضل تركيز للقناة. قبل كل قياس ، استخدم شعاع أكسجين بحجم كيلو إلكترون فولت واحد للمسح الضوئي على نافذة نيتريد السيليكون لمدة 15 ثانية تقريبا لإزالة تلوث السطح. أيضا ، استخدم مسدس الفيضانات الإلكتروني لتعويض شحن السطح أثناء جميع القياسات.

بعد ذلك ، حدد الوضع الإيجابي أو السلبي قبل البدء في الحصول على البيانات. استخدم البزموت 25 كيلو إلكترون فولت ثلاثة زائد كحزمة أيونية أولية في جميع القياسات. لتوصيف العمق ، قم بمسح شعاع الأيونات الأساسي على منطقة مستديرة يبلغ قطرها حوالي ميكرومتر بدقة 32 بكسل × 32 بكسل.

لتقليل الوقت اللازم للثقب من خلال غشاء نيتريد السيليكون ، استخدم شعاعا أيونيا أوليا بعرض نبضة طويل. بعد تثقيب غشاء نيتريد السيليكون ، احتفظ بنفس التيار لمدة 200 ثانية تقريبا للحصول على بيانات كافية لإعادة بناء الصور ثنائية الأبعاد. لجمع البيانات ، قلل عرض النبضة إلى 80 نانو ثانية من أجل الحصول على أطياف بدقة كتلة أفضل.

استمر في هذا الاستحواذ لمدة 200 ثانية أخرى. باستخدام واجهة الموائع الدقيقة SALVI ، يمكن للحزمة الأيونية الأولية أن تقصف مباشرة فيلم الفيبرونيكتين الرطب. يشار إلى عدد من مجموعات المياه وشظايا الأحماض الأمينية من خلال بيانات المواصفات الشاملة ToF-SIMS.

يوفر هذا دليلا مباشرا على خاصية جزيئات الماء المحيطة بجزيئات البروتين المائي وداخلها. هنا ، يمكن للمرء أن يرى العمق ملف تعريف السلسلة الزمنية لفيلم الفيبرونيكتين المائي والماء منزوع الأيونات. تكون شدة الأيونات الثانية المختارة ضئيلة قبل أن يتم ثقب غشاء نيتريد السيليكون.

بمجرد ثقب غشاء نيتريد السيليكون ، تزداد شدة الأيونات الثانوية بشكل كبير. تستخدم عملية عرض النبضة القصيرة للحصول على بيانات ذات دقة كتلة أفضل لإعادة بناء الصور والطيف. تمثل الصور ثنائية الأبعاد من فيلم الفيبرونيكتين المائي والماء منزوع الأيونات عدد الأيونات الثانوية المختارة من العينة.

كلما كانت الصورة أكثر إشراقا ، زاد عدد الأيونات الثانوية. تعطي هذه الصور البديهية مقارنة واضحة للأيونات الثانوية المختارة بين العينات المختلفة ، وهو أمر مفيد في تحليل البيانات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المفاعل الدقيق يجب أن يكون خاليا من التسرب قبل التثبيت في غرفة التفريغ.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء والواجهات الحيوية لاستكشاف امتصاص البروتين ، ومرفق الأغشية الحيوية ، والطبقات الأحادية المجمعة على السطح ، والعديد من الظواهر الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة عينات السوائل المختلفة باستخدام SALVI والسائل ToF-SIMS.