رقاقة سلالة التدرج لتحفيز السلوكيات الخلوي في الخلية لادن المائية

الهدف العام من شريحة إجهاد التدرج هذه هو توفير نهج بسيط لتوليد سلالات ثابتة متدرجة غير مستمرة على هيدروجيل ثلاثي الأبعاد للتحقيق في سلوكيات الخلية في ظل سلسلة من ظروف الإجهاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الهندسة الحيوية مثل تحفيز تمايز الخلايا الجذعية وتنظيم المحاذاة الخلوية لتطوير أعضاء الأنسجة الاصطناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيق سلالات مختلفة على طبقة الخلية والهلاميات المائية في نفس البيئة الدقيقة لمقارنة سلوك الخلية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير الشريحة نظرا لأن الضوء يجب أن يكتمل في غضون ثلاث إلى أربع ساعات لقاعدة التجربة لضمان تباين خلوي مرتفع. قم بوزن 10 جرامات من مسحوق الجيلاتين وأضفه إلى قارورة زجاجية تحتوي على 100 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، أو DPBS. ضع قضيب تقليب مغناطيسي في القارورة وضع القارورة على طبق ساخن مع التحليق.

قم بتغطية القارورة بورق الألمنيوم لتجنب تبخر الماء. اضبط درجة حرارة اللوح الساخن على 50 إلى 60 درجة ومحرك النمام على 100 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة لإذابة مسحوق الجيلاتين. بعد ذوبان الجيلاتين ، أضف ثمانية ملليلتر من أنهيدريد الميثاكريليك ببطء شديد باستخدام ماصة.

دعها تتفاعل عند 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم أضف DPBS الدافئ مسبقا إلى القارورة إلى الحجم النهائي البالغ 500 مل. اترك المحلول يمتزج جيدا لمدة 15 دقيقة لإيقاف التفاعل.

في هذه الأثناء ، قم بقطع غشاء غسيل الكلى إلى عدة أنابيب بطول 25 ملم. اغمرهم في ماء منزوع الأيونات لمدة 15 دقيقة. وقم بعمل عقدة لإغلاق أحد طرفي أنابيب غسيل الكلى.

قم بتحميل الكمية المناسبة من محلول البوليمر في أنابيب غسيل الكلى وأغلق الطرف الآخر. ثم ضع الأنابيب المملوءة في دورق بلاستيكي سعة خمسة لترات بماء منزوع الأيونات لمدة أسبوع. جدد الماء منزوع الأيونات مرتين يوميا والحفاظ على المحلول عند 40 إلى 50 درجة مئوية أثناء عملية غسيل الكلى.

بعد غسيل الكلى ، اجمع المحلول من الأنابيب في زجاجة زجاجية سعة 500 مل. صب ما يقرب من 450 إلى 500 مل من المحلول في كوب فلتر سعة 500 مل. وقم بتطبيق فراغ لإجبار المحلول على المرور عبر غشاء المرشح للتعقيم.

ثم انقل البوليمر المعقم إلى عدة أنابيب معقمة سعة 50 مل. انقل البوليمر المعقم إلى عدة أنابيب معقمة سعة 50 مليلتر وقم بتخزينها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. جفف البوليمر بدرجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة أسبوع واحد باستخدام مجفف التجميد لتشكيل GelMA والذي يمكن تخزينه بعد ذلك في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لتصنيع الرقائق ، قم أولا بإعداد polymethacrylate أو PMMA ، ويتم تشغيله وتشكيله كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم قم بإعداد غطاء PTMS وقابس PTMS عن طريق خلط 30 جراما من المطاط الصناعي PTMS وثلاثة جرامات من عامل معالجة PTMS. قم بإزالة الخليط تحت غرفة مفرغة لمدة ساعة.

صب 1.8 إلى جرامين من الخليط في قالب PMMA لغطاء PTMS. استخدم أيضا الكمية المناسبة لملء كل تجويف لقالب PMMA لقابس PTMS. بالإضافة إلى ذلك ، قم بصب 10 جرامات من خليط PTMS غير المعالج في صفيحة بلاستيكية فارغة 10 سم.

ضع هذه القوالب في غرفة مفرغة من الهواء لتفريغها لمدة 30 دقيقة. عالج PTMS لمدة ساعتين عند 80 درجة مئوية. بعد تبريد PTMS المعالج على القالب ، افصل أغطية PTMS ومقابس PTMS من قوالب PMMA.

بعد ذلك ، قم بعمل فتحتين بأقطار حوالي ثلاثة ملليمترات في نهايات قنوات التدفق لأغطية PTMS. قم بقص لوح PTMS المصبوب من الصفيحة البلاستيكية التي يبلغ طولها 10 سم إلى عدة مكعبات سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد. وقم بعمل ثقب بمقدار ثلاثة ملليمترات في كل مكعب PTMS.

قم بلصق مكعبين غير معالجين بحجم سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد على فتحات غطاء PTMS ليكونوا بمثابة خزانات متوسطة وللمساعدة في عملية معالجة أنماط الهيدروجيل الدائرية المتدرجة. ثم تعالج لمدة ساعة عند 80 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بربط أغطية PTMS بخزاني PTMS على شريحة مطلية ب TMSPMA.

للقيام بذلك ، قم بمعالجة جانب الترابط لغطاء PTMS والشريحة المطلية ب TMSPMA تحت آلة بلازما الأكسجين لمدة 90 ثانية من معالجة بلازما الأكسجين. اتصل بالسطح المعالج بالبلازما لأغطية PTMS وشريحة TMSPMA واضغط عليها عن كثب للترابط الدائم من خلال تكوين رابطة سيليكون الأكسجين السيليكوني. اطبع قناعا ضوئيا عن طريق طباعة التخطيط المحدد على فيلم شفاف.

ثم قم بقص القناع الضوئي المطبوع إلى 25 ملم × 37.5 ملم. تزن 25 ملليغرام من GelMA المجفف بالتجميد إلى 0.3 مل من وسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا في أنبوب طرد مركزي أسود سعة 1.5 مل. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على لوح تسخين مختبر حتى يذوب GelMA في الوسط.

أضف 50 ملليغرام من البادئ الضوئي إلى ملليلتر واحد من DPBS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. وضعه في فرن 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى يذوب المبدئ الضوئي. أضف 25 ميكرولترا من البادئ الضوئي بنسبة 10٪ إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

الماصة عدة مرات لخلط جيدا. بعد ذلك ، عد ثلاثة ملايين خلية NIH3T3 باستخدام عداد خلوي آلي. بعد الطرد المركزي ، التعليق عند 200 Gs لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 175 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا.

أضف محلول الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق للحصول على محلول خلية بوليمر مسبق بنسبة 5٪ GelMA و 0.5٪ بادئ ضوئي وحوالي ستة ملايين خلية 3T3 لكل مليلتر. بعد الخلط ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من البوليمر المسبق للخلية في حقنة دقيقة سعة 100 ميكرولتر. قم بمحاذاة قطعة من القناع الضوئي يدويا على الشريحة السفلية لشريحة إجهاد التدرج المعقمة.

وقم ببساطة بإصلاح الموضع باستخدام قطرة صغيرة من الماء منزوع الأيونات بينهما. قم بتوصيل المحقنة الدقيقة سعة 100 ميكرولتر ، المحملة بمحلول خلية ما قبل البوليمر بمدخل الشريحة. ثم ضع 50 ميكرولترا من محلول خلية البوليمر المسبق في قناة التدفق باستخدام المحقنة الدقيقة وقم بتوصيل المنفذ باستخدام قابس PTMS.

قم بحقن 40 ميكرولترا إضافيا من المحلول لإنشاء انتفاخ محدب في غشاء PTMS الدائري. انقل الشريحة باستخدام قناع الضوء والحقنة الدقيقة وقابس PTMS إلى أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. وقم بتعريضه لمدة 30 إلى 45 ثانية لربط الهيدروجيل الدائري متحد المركز في الغرفة السائلة.

بعد الربط المتقاطع ، قم بإزالة قابس PTMS والحقنة الدقيقة لتحرير ضغط السائل. استخدم حقنة سعة مليلتر واحد محملة ب DPBS مسخن مسبقا لغسل الراتنجات غير المتشابكة ثلاث مرات عن طريق التنظيف من المدخل إلى المخرج. بعد ذلك ، املأ قناة التدفق بحوالي 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا.

ضع الشريحة في طبق استزراع معقم وزراعته في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع. قم بتحديث الوسيط كل يوم. التقط صورا لثلاث رقائق في اليوم صفر بعد أربع ساعات من الحضانة كمجموعة تحكم.

وثلاث رقائق في اليوم الثالث كمجموعة تجريبية باستخدام مجهر بهدف 20 مرة. قم بقياس عرض خط كل هيدروجيل من السطر الأول إلى السطر 12 باستخدام برنامج لحساب بقع الضغط. تظهر هنا النتائج التمثيلية لأنماط الهيدروجيل مع صفر ميكرولتر و 40 ميكرولتر على الحقن ، بعد الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية والحضانة لمدة أربع ساعات.

عرض خط الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد في التحكم في الحقن غير الزائد موحدا كما هو متوقع. ومع ذلك ، فإن أنماط الهيدروجيل التي تحتوي على 40 ميكرولتر على الحقن تعطي عرضا متدرجا للهلاميات المائية يتناقص من السطر الأول إلى السطر 12. بعد ثلاثة أيام من الحضانة ، تمتد الخلايا الموجودة في الهيدروجيل إلى اتجاهات مختلفة.

تتماشى الخلايا الموجودة في الخط الأول على طول الاتجاه الشعاعي بسبب تحفيز استطالة الهيدروجيل. على العكس من ذلك ، تتماشى الخلايا الموجودة في السطر 12 على طول شكل الهيدروجيل حيث تهيمن الإشارة الهندسية على المحاذاة الخلوية. لا توجد محاذاة خلوية محددة في السطر 7 حيث توازن إشارتا المحاذاة الخلوية للخط الأول والخط 12 مع بعضهما البعض.

بمجرد قياس البيئة الدقيقة لسلالات التدرج على هيدروجيل ثلاثي الأبعاد يمكن إجراؤه بواسطة شريحة سلالة التدرج في ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تعقيم شريحة سلالة التدرج قبل تحميل محلول البوليمر الأولي للخلية. امسح أيضا سطح الرقاقة جيدا بنسبة 75٪ من الإيثانول قبل وضع الرقائق في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية إنشاء شريحة إجهاد متدرج للتحقيق في سلوكيات الخلايا تحت سلالات مختلفة إمبراطورية.