وساطة من HSV-التعبير التحوير من همي التركيبات لدراسة وظيفة السلوكية من هذه العملية من Heteromers في الفئران

الهدف العام من هذه الطريقة هو ملاحظة كيف يؤثر نقل الجينات بوساطة الفيروسات على الأنماط الظاهرية السلوكية التي تتطلب تكوين ثنائيات غير متجانسة (heterodimerization) للمستقبلات المقترنة بالبروتين G في نماذج الفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة محورية في مجال الصيدلة العصبية والنفسية، وتحديداً كيفية تفاعل المستقبلات المقترنة بالبروتين G مع بعضها البعض على المستوى الجزيئي.

من خلال استخدام هذه الطريقة، يمكننا فهم كيفية تأثير هذا التفاعل على السلوك في نماذج الاضطرابات النفسية، مثل الفصام والاكتئاب. وباستخدام هذه الطريقة، سنقوم بالبحث بشكل محدد في seratonin 2a و metabotropic glutamate receptor 2، حيث ثبت أن كلاهما متورط في آلية عمل الأدوية المستخدمة لعلاج المرضى المصابين بالفصام. ابدأ بتخدير الفأر بشكل صحيح وفقاً للطرق المعتمدة.

تأكد من الوصول إلى مستوى التخدير الجراحي عن طريق قرص إصبع القدم وملاحظة عدم وجود استجابة. ثم ضع جل العيون لحماية العينين. ثبت الفأر في الإطار المجسم، مع الحرص على ضبط إمالة الرأس بحيث تكون الجمجمة مستوية وأفقية.

ضع البوفيدون أيودين على فروة الرأس المكشوفة. وباستخدام المشرط، قم بإجراء شق سهمي على طول الخط الناصف للجمجمة ضمن المنطقة المحلوقة المكشوفة. بعد ذلك، قم بتثبيت مشابك Pureit على الجلد عند موقع الشق لضمان بقاء الجمجمة مكشوفة.

ضع بيروكسيد الهيدروجين لإذابة السمحاق وكشف دروز الجمجمة. الآن وبعد أن أصبحت الـ bregma والدروز مرئية، تأكد من ضبط الإطار التجسيمي لضمان استواء الجمجمة. قم بمحاذاة رؤوس إبر المحاقن مع الـ bregma وسجل إحداثيات الـ bregma.

للحقن ثنائي الجانب في القشرة الجبهية، أضف 1.6 mm إلى إحداثيات bregma المنقارية الذيلية المسجلة، و2.6 mm إلى إحداثيات bregma الإنسية الجانبية المسجلة. حدد مواقع الحقن على الجمجمة ثم احفر ثقوباً صغيرة عند هذه المواقع. وباستخدام مسحة قطنية، قم بإزالة أي دم زائد أو شظايا عظمية.

قرب الإبرة من سطح الدماغ، ثم اخفضها إلى عمق الإحداثيات الظهرية البطنية. بعد ذلك، احقن محتويات السرنجة ببطء عن طريق تدوير مكبس الإبرة لضخ 0.1 µL لكل دقيقة لمدة خمس دقائق، ليصبح إجمالي الحقن 0.5 µL. اترك السرنجة في مكانها لمدة خمس دقائق.

بعد انقضاء الوقت المحدد، قم بإخراج الحيوان من جهاز التوجيه المجسم (stereotaxis)، وأغلق الشق الجراحي، ثم وضعه على وسادة تدفئة. قم بإعطاء المسكنات بعد الجراحة وفقاً لبروتوكول الحيوانات المعتمد لديك. أجرِ الاختبارات السلوكية بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحقن المجسم للجزيئات الفيروسية.

يجب تعويد الفئران على الغرفة لمدة أربع ساعات على الأقل قبل بدء التجربة. ابدأ بإذابة DOI في محلول ملحي بتركيز 0.9% ليصل التركيز إلى 2 mg/kg. جهّز قفصاً منزلياً بدون أي فرشات، وباستخدام حامل ثلاثي القوائم، اضبط الكاميرا بحيث تكون مباشرة فوق القفص المنزلي.

قم بمعايرة الكاميرا بحيث تكون القفص الرئيسي بالكامل ضمن مجال الرؤية. زن الفأر ثم احقنه داخل الصفاق بالجرعة المناسبة من المحلول الملحي بتركيز 0.9% أو DOI. ضع الفأر مرة أخرى في القفص الرئيسي لمدة عشر دقائق.

بعد مرور عشر دقائق، ضع الفأر في وسط القفص المنزلي الفارغ، وتأكد من عدم وجود أي نقاط عمياء في مجال رؤية الكاميرا. اضغط على زر التسجيل في كاميرا الفيديو ثم غادر الغرفة. وبعد مرور 30 دقيقة، أوقف التسجيل وأعد الفأر إلى قفصه المنزلي الأصلي.

كرر الاختبار السلوكي على الفأر التالي. اجعل المحكم يراجع مقاطع الفيديو دون معرفة الظروف التجريبية. سجل يدوياً كل حركة ارتعاش للرأس طوال مقطع الفيديو.

تُعرَّف رفة الرأس بأنها حركة اهتزازية سريعة للرأس يقوم بها الفأر. قم بمعالجة البيانات كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول. تظهر هنا صورة تمثيلية للتعبير عن الجين المنقول بوساطة HSV في القشرة الجبهية.

تم حقن HSV mGlu2 GFP في القشرة الجبهية، وكُشف عن تعبير GFP عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. يمثل شريط المقياس هذا 200 microns. تُظهر هذه الصورة لطخة ويسترن لتعبير الجين المنقول بوساطة HSV وتفاعل anti-mGlu2 في القشرة الجبهية لفئران mGlu2 knockout.

قمنا هنا بقياس التفاعل المناعي لـ mGlu2 كـ monomer. يوضح هذا المدرج التكراري أن التعبير عن mGlu2 بوساطة الفيروسات، وليس mGlu2 الخيمري في القشرة الجبهية للفئران التي تعاني من نقص mGlu2، يستعيد بشكل ملحوظ استجابة ارتجاف الرأس الناتجة عن DOI، وهو ناهض لمستقبلات السيروتونين 2a المهلوسة. وتتمثل الخطوات الأكثر أهمية في هذه التجربة في التوقيت الفاصل بين الحقن الفيروسي، واستجابة ارتجاف الرأس، ووقت التضحية بالفئران.

أي تأخير قد يؤدي إلى تغيير نتائج التجربة أو إدخال غموض على البيانات. بمجرد إتقان العملية، ستستغرق جراحة الفأر حوالي 30 دقيقة لحقن الفيروس. كما ينبغي أن تستغرق تجربة تشنج الرأس حوالي 35 دقيقة لكل فأر.

يُنصح بتنظيم الجراحات على مراحل، أو إجراء الجراحة لأكثر من فأر واحد في المرة ذاتها. تتيح هذه الطريقة الحفاظ على جدول زمني يسمح بإجراء تجارب تشنج الرأس في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام بعد الجراحة، وهي فترة ذروة تعبير البنية الفيروسية. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجربتكم.