وساطة من HSV-التعبير التحوير من همي التركيبات لدراسة وظيفة السلوكية من هذه العملية من Heteromers في الفئران
يوليو 9, 2016
توضح هذه المقالة كيفية حقن ناقلات فيروسية في القشرة الأمامية الماوس لاختبار المقايسات السلوكية التي تتطلب هذه العملية من تشكيل مغايرة التغصن.
الهدف العام لهذه الطريقة هو ملاحظة كيفية تأثير نقل الجينات بوساطة الفيروس على الأنماط الظاهرية السلوكية التي تتطلب تغايرة المستقبلات المقترنة ببروتين G في نماذج الفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأدوية العصبية والنفسية. على وجه التحديد كيف تتفاعل المستقبلات المقترنة ببروتين g مع بعضها البعض على المستوى الجزيئي.
باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا أن نفهم كيف يؤثر هذا التفاعل على السلوك في نماذج الاضطرابات النفسية ، مثل الفصام والاكتئاب. باستخدام هذه الطريقة ، سننظر على وجه التحديد إلى السيراتونين 2a ومستقبلات الغلوتامات الأيضية 2 ، وكلاهما ثبت أنه متورط في آلية عمل الأدوية المستخدمة لعلاج مرضى الفصام. ابدأ بتخدير الماوس بشكل صحيح وفقا للطرق المعتمدة.
تأكد من الحصول على مستوى جراحي للتخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم وملاحظة عدم وجود استجابة. ثم ضع جل العيون لحماية العينين. قم بتوصيل الماوس بالإطار التجسيمي ، مع التأكد من ضبط إمالة الرأس بحيث تكون الجمجمة مستوية ومسطحة.
ضع بوفيدون اليود على فروة الرأس المكشوفة. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق سهمي على طول خط الوسط للجمجمة داخل المنطقة المحلوقة المكشوفة. ثم قم بتوصيل المشابك النقية بالجلد في موقع الشق للتأكد من بقاء الجمجمة مكشوفة.
ضع بيروكسيد الهيدروجين لإذابة السمحاق وفضح خيوط الجمجمة. الآن بعد أن أصبحت البريجما والخيوط مرئية ، تأكد من ضبط الإطار التجسيمي للتأكد من أن الجمجمة مستوية. قم بمحاذاة أطراف إبرة المحاقن مع بريجما وسجل إحداثيات بريجما.
لحقن القشرة الأمامية ثنائيا ، أضف 1.6 مم إلى إحداثيات بريجما الذيلية المنقارية المسجلة ، و 2.6 مم إلى إحداثيات بريجما الجانبية الإنسية المسجلة. ضع علامة على مواقع الحقن على الجمجمة ثم حفر ثقوب صغيرة في مواقع الحقن. باستخدام قضيب قطني ، امسح أي دم زائد أو شظايا عظام.
أحضر الإبرة إلى سطح الدماغ ، وخفضها إلى عمق الإحداثيات البطنية الظهرية. ثم قم بحقن محتويات المحقنة ببطء عن طريق لف مكبس الإبرة لإدارة 0.1 ميكرولتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، لحقن 0.5 ميكرولتر. اترك المحقنة في مكانها لمدة خمس دقائق.
بعد الوقت المخصص ، قم بإزالة من التجسمية ، وأغلق الشق ، وضعه على وسادة تسخين. قم بإعطاء تسكين ما بعد الجراحة وفقا لبروتوكول المعتمد الخاص بك. إجراء الاختبارات السلوكية بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحقن التجسيمي للجزيئات الفيروسية.
اعتاد الفئران على الذهاب إلى الغرفة لمدة أربع ساعات على الأقل قبل بدء التجربة. ابدأ بإذابة DOI في محلول ملحي بنسبة 0.9 في المائة إلى ملليغرامين لكل كيلوغرام. قم بإعداد قفص منزلي بدون أي فراش وباستخدام حامل ثلاثي القوائم ، اضبط الكاميرا بحيث تكون فوق قفص المنزل مباشرة.
قمبمعايرة الكاميرا بحيث يكون قفص المنزل بأكمله في مجال الرؤية. قم بوزن الفأر وحقنه داخل الصفاق بالجرعة المناسبة إما 0.9 في المائة من محلول ملحي أو DOI. ضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل لمدة عشر دقائق.
بعد عشر دقائق ، ضع الماوس في وسط قفص المنزل الفارغ ، وتأكد من عدم وجود نقاط عمياء في مجال رؤية الكاميرا. اضغط على التسجيل على كاميرا الفيديو واترك الغرفة. بعد 30 دقيقة ، أوقف التسجيل وأعد الماوس إلى قفص المنزل الأصلي.
كرر الاختبار السلوكي على الماوس التالي. اطلب من الحكم مراجعة مقاطع الفيديو أعمى عن الظروف التجريبية. سجل يدويا كل ارتعاش في الرأس طوال الفيديو.
يعرف ارتعاش الرأس بأنه حركة اهتزاز سريع للرأس يقوم به الفأر. قم بمعالجة البيانات كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول. تظهر هنا صورة تمثيلية للتعبير الجيني المعدل بوساطة فيروس الهربس البسيط في القشرة الأمامية.
تمحقن HSV mGlu2 GFP في القشرة الأمامية وتم الكشف عن تعبير GFP بواسطة الكيمياء المناعية. يمثل شريط المقياس هذا 200 ميكرون. تظهر هذه الصورة لطخة غربية من التعبير الجيني المعدل بوساطة فيروس الهربس البسيط والتفاعل المضاد ل mGlu2 في القشرة الأمامية للفئران بالضربة القاضية mGlu2.
قمنا هنا بقياس النشاط المناعي ل mGlu2 كمونومر. يوضح هذا الرسم البياني أن التعبير الفيروسي بوساطة mGlu2 ، ولكن ليس عن mGlu2 الخيمري في القشرة الأمامية للفئران بالضربة القاضية mGlu2 ينقذ بشكل كبير استجابة ارتعاش الرأس الناجمة عن ناهض مستقبلات السيراتونين 2a المهلوس. أهم الخطوات في هذه التجربة هي التوقيت بين الحقن الفيروسية ، واستجابة ارتعاش الرأس ، ووقت التضحية بالفئران.
يمكن لأي تأخير أن يغير نتائج التجربة أو يدخل غموضا في البيانات. بمجرد إتقانها ، ستستغرق جراحة الفأر حوالي 30 دقيقة لحقن الفيروس. يجب أن تستغرق تجربة ارتعاش الرأس أيضا حوالي 35 دقيقة لكل فأرة.
يوصى بإجراء عمليات جراحية مذهلة أو إجراء عمليات جراحية على أكثر من فأرة واحدة في وقت واحد. بهذه الطريقة يمكن للمرء أن يحافظ على جدول زمني يسمح بإجراء تجارب ارتعاش الرأس في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام بعد الجراحة وهو وقت ذروة التعبير عن الهيكل الفيروسي. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لحقن المتجهات الفيروسية في القشرة الأمامية للفأر لدراسة المقايسات السلوكية المتعلقة بتكوين GPCR الثنائي الاختلاف. يهدف هذا النهج إلى توضيح التفاعلات الجزيئية للمستقبلات المقترنة بالبروتين G وتأثيرها على السلوك في النماذج النفسية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الصيدلة
- علم السلوك
الخلفية
- تلعب المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) دورًا حيويًا في الإرسال العصبي.
- يمكن أن يوفر فهم تفاعلات GPCR رؤى حول الاضطرابات النفسية.
- قد تؤثر ثنائية الاختلاف لـ GPCRs على النتائج السلوكية.
- تستخدم هذه الطريقة المتجهات الفيروسية لنقل الجينات في نماذج الفئران.
هدف الدراسة
- للتحقيق في تأثيرات نقل الجينات بوساطة الفيروس على الأنماط الظاهرية السلوكية.
- لاستكشاف التفاعل بين مستقبلات السيروتونين 2A ومستقبل الغلوتامات المتحول.
- لمعالجة الأسئلة في علم الصيدلة العصبية والنفسية.
الطرق المستخدمة
- تخدير الفئران بشكل صحيح وفقًا للطرق المعتمدة.
- حقن المتجهات الفيروسية في القشرة الأمامية.
- مقايسات سلوكية لتقييم تأثير تفاعلات GPCR.
- تحليل الأنماط الظاهرية السلوكية المتعلقة بالاضطرابات النفسية.
النتائج الرئيسية
- رؤى حول تكوين GPCR الثنائي الاختلاف ومضامينه السلوكية.
- فهم دور مستقبلات السيروتونين 2A ومستقبل الغلوتامات المتحول.
- روابط محتملة بين تفاعلات GPCR والظروف النفسية.
- المساهمة في مجال علم الصيدلة العصبية من خلال النتائج التجريبية.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة إطارًا لدراسة تفاعلات GPCR في الجسم الحي.
- قد تفيد النتائج الاستراتيجيات العلاجية للاضطرابات النفسية.
- تحتاج المزيد من الأبحاث لاستكشاف مضامين هذه التفاعلات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Dissecting the behavioral function of GPCR heteromers using HSV-mediated transgene expression in mice addresses a critical challenge in neuropsychiatric drug discovery: establishing mechanistic links between receptor complexes and disease-relevant phenotypes. This approach enables predictive confidence in target validation for psychiatric disorders by isolating the functional necessity of specific receptor interactions. The method supports risk-adjusted portfolio decisions at the interface of early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of GPCR heteromer function in vivo for mechanistic de-risking.
- Clarifies the necessity of specific receptor complexes for disease-relevant behavioral phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection for neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays linked to molecular interventions for downstream screening.
- Provides quantitative behavioral outputs (head-twitch response) for assay standardization.
- Facilitates reproducible evaluation of genetic and pharmacological manipulations in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical behavioral models with human disease mechanisms via receptor complex interrogation.
- Enables continuity from molecular discovery to behavioral validation in animal models.
- Supports translational biomarker development by linking molecular interventions to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of receptor complex function in disease-relevant behavioral systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for GPCR heteromer involvement in psychiatric phenotypes.
- Screening: Provides a platform for quantitative behavioral readouts following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Delivers measurable endpoints (head-twitch counts) for statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to behavioral outcomes relevant to psychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for interrogating other receptor complexes in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for neuropsychiatric drug programs.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping linked to molecular interventions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the necessity of receptor complexes for disease-relevant behaviors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms for advancement in CNS pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and behavioral phenotyping in rodents.
- Demands access to viral vector production and molecular validation infrastructure (immunocytochemistry, western blotting).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection timing, behavioral testing, and data analysis.
- Adaptation to other receptor complexes or behavioral assays may require protocol optimization.
- Precise timing between viral delivery, behavioral assessment, and tissue collection is critical for data integrity.
