أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف في وقت واحد عن أكسيد النيتريك داخل الخلايا وأنيونات الأكسيد الفائق باستخدام صبغة التألق DAF-2DA و DHE في الشريان الأورطي السليم للفأر المعزول حديثا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تعافي حالة الباحث في المختبر في مجال فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية مثل الخلل البطاني وفصل eNOS. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في توفير طريقة بسيطة ودقيقة للكشف المباشر خارج الجسم الحي وتصور أكسيد النيتريك وأنيون الأكسيد الفائق في وقت واحد في الأوعية الدموية السليمة.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم ببناء نظام حمام الأعضاء الذي يمكن تسخينه إلى 37 درجة مئوية وتهويته بنسبة 95٪ أكسجين ، 5٪ غاز ثاني أكسيد الكربون من خزان غاز الكربون. للبدء ، قم بإعداد ما يكفي من Krabs-Ringer Bicarbonate Buffer الطازج حسب الحاجة لاستحمام الأنسجة ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى 200 مل للشريان الأورطي في تجربة واحدة.

قم بتشغيل نظام حمام الأعضاء واضبط التحكم في الحرارة على 37 درجة مئوية. بعد غسل الغرف باستخدام Krabbs-Ringer Bicarbonate Buffer ، أضف خمسة ملليلتر من Krabs-Ringer Bicarbonate Buffer إلى كل غرفة وقم بتشغيل الغاز لتهويته بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. حافظ على الغرف مغطاة.

أيضا ، قم بإعداد زجاجة من Krabs-Ringer Bicarbonate Buffer المثلج مع التهوية. بعد استئصال الشريان الأورطي الصدري ، اغمر الأنسجة بالكامل على الفور في طبق مع عازلة Krebs-Ringer المثلجة. تحت مجهر التسليح، قم بإزالة القلب والقوس الأبهري مع الحفاظ على الجزء الأبهري الصدري في المخزن العازل.

بعد ذلك ، قم بتشريح الشريان الأورطي الخالي من الالتصاق الأنسجة المحيطة بالأوعية الدموية باستخدام المقص الجراحي والملقط. بعد ذلك ، استخدم الملقط لإمساك حافة الأنسجة وطرد الدم برفق من تجويف الأوعية الدموية باستخدام عازلة Krebs-Ringer المثلجة التي يتم توصيلها من حقنة. يجب التخلص من الجلطات الدموية في تجويف الأوعية الدموية لأنها قد تسبب إشارات اصطناعية وتتداخل مع إشارات الفلورسنت بينما في نفس الوقت ، يجب التحكم في قوة التنظيف حتى لا تتلف الطبقة البطانية.

الآن ، قم بتقطيع حلقات الأبهر النظيفة إلى شرائح بطول ثلاثة ملليمترات. بعد تحضير حلقات الأبهر التي تم تنظيفها ، قم بتلطيخها. عند لمس الجانب العرضي فقط من حلقات الأبهر بالملقط ، دون تثبيت الأوعية الدموية ، قم بنقل أجزاء الأبهر التي تم تنظيفها إلى غرف حمام الأعضاء المعدة.

دع الشرايين تتوازن في المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة. بعد نصف ساعة ، أضف الأسيتيل كولين إلى حمام الأعضاء لإعطاء تركيز نهائي من ميكرومولار واحد واحتضان الشرايين لمدة 10 دقائق باستخدام الأسيتيل كولين. في هذه الأثناء ، في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، قم بإعداد مليلتر من محلول التلوين باستخدام عازلة كريبس الدافئة مسبقا.

بعد ذلك ، لف الأنبوب بورق الألمنيوم لتقليل التعرض للضوء والاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية. بعد تحفيز الأسيتيل كولين ، انقل حلقات الأبهر من حمام العضو إلى أنبوب محلول التلوين واتركها تحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام مع التهوية. يجب أن تتم جميع الخطوات من هذه النقطة فصاعدا بأقل قدر من التعرض للضوء.

بعد ذلك ، انقل حلقات الأبهر إلى أنبوب جديد مملوء بمخزن كريبس المؤقت لمدة دقيقة. قم بتنفيذ خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإصلاح الحلقات الأبهرية في حمام من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد خطوة التثبيت ، انقل الحلقات إلى محلول DAPI لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لتطبيق البقعة المضادة. ثم اغسل حلقات الأبهر باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. كن دائما حساسا لهشاشة الأنسجة البطانية عند تحريك الحلقات.

تحت المجهر ، قم بقص حلقات الأبهر طوليا باستخدام مقص جراحي مجهري على شريحة. ثم قم بإزالة أي سائل زائد على الشريان الأورطي مع إبقائه رطبا. إجبار الشريان الأورطي الملفوف بشكل مسطح على منزلق مع توجيه البطانة لأسفل على الشريحة الزجاجية باستخدام ملقطين جراحيين مجهريين.

في هذه العملية ، لا تحرك الشريان الأورطي ذهابا وإيابا. هذه الخطوة بالغة الأهمية ، ولكنها ليست سهلة التشغيل. من الأفضل التدرب جيدا قبل التجربة الرسمية.

ثم قم بإسقاط وسط التثبيت على الشريان الأورطي. قم بتغطية الشريحة وإغلاقها بطلاء الأظافر. بعد التجفيف بالهواء في الظلام ، قم بتصوير الشرائح باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

استخدم سرعة مسح ضوئي تبلغ 200 هرتز ، ودقة 1024 × 1024 بكسل ، وحجم z-stack يبلغ ربع ميكرون. لمراقبة DAF-2DA ، استخدم ليزر الأرجون ، واضبط مضان الإثارة على 488 نانومتر ، وكشف الانبعاث عند 515 نانومتر. لمراقبة DHE ، اضبط مضان الإثارة على 514 نانومتر واضبط الكشف على 605 نانومتر.

بعد التركيز البؤري بتكبير 10 أضعاف ، اضبط الهدف على تكبير 40x. الآن ، حدد نطاق الطبقة البطانية عن طريق ضبط موضع z على لوحة التحكم ، باستخدام النوى الملطخة ب DAPI كمعالم. بعد ذلك ، قم بالمسح الضوئي من الطبقة البطانية على حدود التجويف من خلال السماكة الكاملة للطبقة البطانية وسجل الصور.

امسح ثلاثة حقول رؤية مختلفة على الأقل لكل عينة. أصيبت الفئران الصغيرة C57 السوداء 6 بالسمنة من خلال إطعامها نظاما غذائيا غنيا بالدهون لمدة 14 أسبوعا. تم تغذية الضوابط بتغذية طبيعية.

بعد 14 أسبوعا ، تم فحص الشرايين الصدرية الخاصة بهم. قبل التلوين ، تعرضت الأنسجة لمثبط eNOS L-NAME لمدة ساعة عند ضرار نانوي واحد. يتم تحويل الإشارة من DAF-2T ، التي تظهر باللون الأخضر ، من DAF-2 غير الفلوري بواسطة أكسيد النيتريك.

لذلك ، يشير التلوين إلى وجود أكسيد النيتريك في الخلية. وبالمثل ، عندما يتأكسد بواسطة الأكسيد الفائق ، يعطي DHE إشارة فلورية حمراء. لذا ، فإن العينات التي تظهر المزيد من اللون الأحمر تحتوي على المزيد من الأكسيد الفائق في الخلايا.

كشف القياس الكمي للصور المضان متحد البؤر عن انخفاض في إنتاج أكسيد النيتريك وزيادة في توليد أكسيد فائق حساس ل L-NAME في الطبقة البطانية الأبهرية للفئران التي تغذت على نظام غذائي غني بالدهون. تدعم هذه البيانات فكرة أن فصل eNOS يحدث مع السمنة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف أكسيد النيتريك وأنيونات الأكسيد الفائق ، واستخدام الأصباغ الفلورية في الأوعية الدموية السليمة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الطبقة البطانية في لباقة أثناء إجراء العملية بأكمله. واغمر الأوعية الدموية دائما في مخزن Krebs-Ringer المخزن المؤقت للحفاظ على الخلايا البطانية حية قبل خطوة التثبيت.

بالجمع بين هذا الإجراء ، يمكن إجراء تدابير أخرى مثل تحليل الاستجابات الحركية الوعائية للأوعية الدموية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الوظيفة الفسيولوجية للخلايا البطانية في تنظيم توتر الأوعية الدموية.