والكمي Glycomics والبروتيوميات المشتركة الاستراتيجية تنقية

الهدف العام من سير العمل القائم على المرشح الفردي هو تنقية N-glycans والبروتينات بسهولة وكمية جنبا إلى جنب من العينات البيولوجية من تحليل قياس الطيف الكتلي. إن قابلية التوسع والسرعة والاستنساخ التحليلي لهذه الطريقة تجعلها متاحة مباشرة فيما يتعلق بالموارد ومجموعات المهارات لمختبرات قياس الطيف الكتلي البيولوجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بالتحقيق في علم السكر السكري وإشغال موقع الارتباط بالجليكوزيل وأسئلة البروتينات في وقت واحد في الدراسات البيولوجية عالية الإنتاجية واسعة النطاق.

لقد تغلبنا على تحديات قياسات N-glycan من خلال اقتران هذه الطريقة باستراتيجية اشتقاق مصممة خصيصا لقياس الطيف الكتلي مما أدى إلى تقدير دقيق ونسبي بين حالات السرطان والسيطرة. مع انخفاض التباين التحليلي ، يمكن توضيح التفاعلات البيولوجية الجديدة بين الغليكوم والبروتين ، مما ينتج عنه رؤى رئيسية حول حالات المرض وفرص جديدة لاكتشاف المؤشرات الحيوية. للبدء ، قم بتحميل 2.5 ميكرولتر من البلازما على مرشح.

ثم أضف 2 ميكرولتر من محلول 1M dithiothreitol إلى كل عينة في الفلتر. خفف العينة ب 200 ميكرولتر من 100 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم PNGase هضم المخزن المؤقت. قم بتغطية أنبوب عينة المرشح والدوامة برفق ، مع الحرص على عدم إزعاج المرشح من مقعده.

احتضان العينة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتشويه طبيعة البروتينات والبروتينات السكرية. لأقلة العينات ، أضف 50 ميكرولترا من 1M Iodoacetamide لإعطاء تركيز نهائي يبلغ حوالي 200 مليمتر. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

ركز البروتين السكري المشوه على المرشح عن طريق الطرد المركزي للعينات عند 14،000 × جم لمدة 40 دقيقة قبل التخلص من التدفق. اغسل العينة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase. ركز البروتين السكري على الفلتر وتخلص من التدفق.

كرر خطوة الغسيل والتركيز مرتين لمدة ثلاث مرات ، مما ينتج عنه تركيز في الحجم الميت للفلتر. تخلص من كل التدفق وقارورة التجميع بمجرد اكتمال الغسيل. بعد ذلك ، أضف 2 ميكرولتر من الببتيد الخالي من الجلسرين N-glycosidase F أو PNGase F إلى الفلتر بعد نقله إلى قارورة تجميع جديدة.

أضف 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم PNGase ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر، وقم بتمرير الماصة برفق لأعلى ولأسفل على الفلتر للخلط. للحصول على ارتفاع في بروتوكول الهضم ، احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة ساعتين. العمل بسرعة ، قم بإزالة العينات وقم بزيادة 2 ميكرولتر إضافي من PNGase F الخالي من الجلسرين ، قم بدوامة العينات برفق لمدة 1 إلى 2 ثانية لخلطها.

احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة ساعتين إضافيتين. بعد مراوغة الجليكان عن طريق الطرد المركزي للعينة عند 20 درجة مئوية ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase إلى المرشح وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. اجمع الغسيل الذي يحتوي على أي جليكان متبقي مرتبط ب N في نفس قارورة التجميع مثل مادة المزيع.

بعد التكرار مرتين ، قم بإزالة الفلتر وضعه في قارورة تجميع جديدة لتحضير البروتينات. بعد ذلك ، احتضان عينات الجليكان في الفريزر 80 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة حتى تتجمد. ثم يجف حتى الانتهاء في درجة حرارة الغرفة في مكثف مفرغ لمدة 4 إلى 6 ساعات.

اشطف الفلتر الذي يحتوي على الببتيدات المنعشة ب 400 ميكرولتر من محلول اليوريا 8M. قم بتغطية قارورة المجموعة ودوامة برفق للخلط. ركز الببتيدات على الفلتر قبل التخلص من كل التدفق من خلاله.

بعد تكرار غسل اليوريا العازلة مرتين أخريين ، اشطف الفلتر الذي يحتوي على الببتيدات المنكوبة باستخدام محلول هضم التربسين. قم بتغطية قارورة التجميع ودوامة برفق للخلط قبل التركيز على الفلتر مرة أخرى كما كان من قبل. تخلص من كل التدفق وكرر مرتين إضافيتين ليصبح المجموع 3 غسلات عازلة من التريبسين.

اجمع كل المواد المزيئة والغسول المستقبلي في قارورة مجموعة جديدة. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من التربسين المعدل بالخنازير بنسبة 1:50 من التربسين إلى البروتين لاكتشاف البروتينات أو نسبة 1: 5 من التربسين إلى البروتين لتجارب البروتينات الكمية. قم بتغطية قارورة المجموعة ودوامة برفق للخلط.

بعد احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، اعمل بسرعة لإزالة العينات وزيادة 50 ميكرولترا إضافيا من التربسين بنسبة التربسين إلى البروتين المناسبة. قم بدوامة العينات برفق لمدة 1 إلى 2 ثانية لخلطها. ثم احتضن عند 50 درجة مئوية لمدة ساعتين إضافيتين.

بعد شطف الببتيدات عن طريق الطرد المركزي كما كان من قبل لمدة 20 دقيقة ، اشطف الببتيدات المتبقية من المرشح باستخدام المخزن المؤقت لإخماد. قم بإزالة الفلتر عن طريق الطرد المركزي كما كان من قبل لمدة 15 دقيقة. بعد تحديد تركيز الببتيد في العينات ، قم باحتضان عينات الببتيد في الفريزر 80 درجة مئوية حتى تتجمد.

ثم يجف حتى الانتهاء في درجة حرارة الغرفة في مكثف مفرغ لمدة 4 إلى 6 ساعات. ثم البروتينات التربتية قبل قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة أو تحليل LCMS في المرحلة المتنقلة A إلى التركيز المطلوب. تتراوح تركيزات الببتيد التريب من 2.5 ميكرولتر من البلازما من 100 إلى 300 نانوغرام لكل ميكرولتر.

قبل تحليل الجليكان ، أعد تكوين النظير المستقر المجفف المسمى كواشف 4-فينيثيل البنزوهيدرازيد ، بالإضافة إلى كواشف P2GPN الأصلية في مليلتر واحد من محلول الاشتقاق للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.25 ملليغرام لكل مليلتر. ستستغرق الكواشف ما يصل إلى 10 دقائق حتى تذوب تماما. دوامة على نطاق واسع لضمان الذوبان الكامل.

ضع علامة على N-glycans المجففة ب 200 ميكرولتر من كاشف P2GPN الأصلي أو المسمى بالنظائر المستقرة. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الجليكان المجفف. بعد ذلك ، قم بتدوير العينات وتدويرها لمدة 5 ثوان تقريبا على جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء.

تفاعل الجليكان مع الكاشف لمدة 3 ساعات عند 56 درجة مئوية. انقل الجليكان على الفور من الحاضنة إلى مكثف الفراغ وجففه حتى الانتهاء عند 55 درجة مئوية لمدة 3 إلى 5 ساعات. أعد تعليق N-glycan الموسومة في 25 إلى 50 ميكرولترا من الماء قبل تحليل الكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي.

الماصة لأعلى ولأسفل لضمان إذابة N-glycans بالكامل. بعد طرد العينات كما كان من قبل لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، مع الحرص على عدم ترك طرف الماصة يلمس الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. اجمع بين زوج من العينات الأصلية والمستقرة ذات النظائر المعينة بنسبة 1: 1 لتحليل ترادفي القياس الكمي النسبي.

قم بإعداد 2 طرق مختلفة ل LCMS لسير عمل البروتينات وعلم السكر في الدم. لتحليل البروتين ، قم بحقن ما يقرب من 400 نانوجرام من البروتين على العمود في NPA. قم بتشغيل العينة بمعدل 300 نانولتر في الدقيقة ، مع توازن عمود مسبق 1 ميكرولتر وتوازن عمود تحليلي 5 ميكرولتر.

تأين البروتينات في ظل ظروف MS المنصوص عليها في بروتوكول النص. لتحليل الجليكان ، قم بحقن 5 ميكرولترات من عينات P2GPN المعاد تعليقها وذات العلامات الأصلية المستقرة والمصنفة بالنظائر المستقرة على العمود. قم بتشغيل العينة بسرعة 300 نانولتر في الدقيقة مع توازن عمود مسبق 2 ميكرولتر وتوازن عمود تحليلي 5 ميكرولتر.

بعد ذلك ، قم بتأين الجليكان في ظل ظروف MS المنصوص عليها في بروتوكول النص. تمت مقارنة بروتوكول التنقية القائم على المرشح بطريقة استخراج الطور الصلب القياسية ولم تكن وفرة جليكان البلازما المكتشفة بين البروتوكولين مختلفين بشكل كبير. في كلتا الطريقتين ، تم العثور على نفس الجليكان بالقرب من حد الكشف حيث يزداد التباين.

تم تقييم التباين لخلطات equiM للبلازما المنقاة بواسطة بروتوكول استخراج الطور الصلب القائم على المرشح أو القياسي. كان لكلا البروتوكولين توزيعات غاوسية لم تختلف وسائلها اختلافا كبيرا عن الصفر. سقط 80 في المائة من الجليكان في إطار تغيير مزدوج.

تكن توزيعات الوزن الجزيئي للجليكانات المكتشفة في بروتوكولات التنقية الجديدة والتقليدية مختلفة بشكل كبير وغطت نفس النطاق. من الناحية النوعية ، لم يلاحظ أي تحيز بين الجليكانات. تم تحضير بروتينات البلازما عن طريق تحضير العينات القياسية بمساعدة المرشح وبروتوكولات متعددة في الخط.

كان عدد البروتينات التي تم تحديدها متشابها بالنسبة للبروتوكولات المختلفة. تم التحكم في إزالة التآكل غير المحدد في الهضم بالميكروويف وبروتوكولات عسر الهضم إلى أقل من 10 في المائة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن إشغال موقع الغليكوزيلات الدقيق يتوقف على تقليل التعرض للحرارة والوقت.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تنقية pecurikene N-glycan المضمنة في 2 أيام. باتباع هذا الإجراء ، يمكن دمج القياس الكمي الدقيق للبروتين N-glycan وإشغال موقع الغليكوزيلات ونمذجتها باستخدام تقنيات إحصائية عالية المستوى. توفر هذه التقنية القدرة على قراءة اللغة المعقدة التي يتحدث بها بيولوجيا السرطان بسرعة ، ومقارنة الاختلافات في علاجات البروتين كميا ، والكشف حقا عن أهمية الارتباط بالجليكوزيل في السياق البيولوجي.