عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل الخلايا المناعية اللثوية من أجل التوصيف المتعمق للاستجابات المناعية المتعلقة بالمناعة الفموية والتهاب دواعم السن. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة الفموية، مثل العوامل الخلوية المتورطة في نشوء مرض التهاب دواعم السن. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتقييم شبكة الخلايا المناعية الفموية وعزل عدد كافٍ من الخلايا الحية لإجراء الاستقصاءات اللاحقة خارج الجسم (in-vitro).

كخطوة أولى في هذا البروتوكول، ابدأ بتثبيت جسم الفأر باستخدام الدبابيس وفتح التجويفين الصدري والبطني لكشف القلب والأعضاء الداخلية. بعد ذلك، قم بعمل شق في الوريد الأجوف، واستخدم سرنجة سعة 3 milliliters، مزودة بإبرة قياس 27-gauge، لضخ 3 milliliters من PBS عبر البطين الأيسر. وعند غسل جميع الدماء، ثبت رأس الفأر على لوحة التشريح، بحيث تكون المعدة متجهة للأعلى.

ثم استخدم المقص لقص كل زاوية من زوايا الشفة باتجاه الرقبة، لفصل الجلد الذي يغطي الفك السفلي ومنطقة الرقبة، وكشف الأنسجة والعضلات الكامنة. قم بالقص بين القواطع السفلية لفصل جانبي الفك السفلي. قم بتثبيت كل جانب من جانبي الفك السفلي المفصول باستخدام إبر قياس 25-gauge للوصول إلى تجويف الفم.

بعد تحديد موقع الحنك، استخدم شفرة جراحية رقم 10 لإجراء شقوق عمودية أمام الضرس الأول مباشرة، وخلف الضرس الثالث. بعد ذلك، قم بتشريح الأنسجة بعيداً عن التجويف الأنفي، وكذلك فصل الكتل عن الفك السفلي. ثم تخلص من الأنسجة الزائدة من حافة اللثة وانقل كتل الفكين العلوي والسفلي إلى أنبوب مخروطي سعة 50-milliliter يحتوي على 5 milliliters من collagenase و DNase على الثلج.

قم بهضم الأنسجة في حاضنة هزازة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، مع إضافة 50 µL من EDTA بتركيز 0.5 M خلال الدقائق الخمس الأخيرة. بعد ذلك، أضف 5 mL من وسط DNase البارد إلى الأنسجة، واخلط محتويات الأنبوب برفق عن طريق التدوير. ثم انقل قطع الأنسجة الأربع إلى طبق بتري.

ثم غطِّها بـ 500 µL من وسط DNase الطازج. استخدم مشرطاً لإزالة اللثة من كل كتلة نسيجية. ثم انقل محتويات الطبق بالكامل إلى مصفاة خلايا بمسامية 70 micron موضوعة فوق أنبوب سعة 50 mL.

اغسل طبق بتري والمصَفّاة بـ 3 إلى 5 milliliters من وسط DNase الطازج. ثم استخدم مكبس حقنة معقمة سعة 3 milliliters لهرس أنسجة اللثة مقابل شبكة المصَفّاة. اشطف المصَفّاة بـ 30 إلى 35 milliliters من وسط DNase البارد، ثم قم بـ طرد مركزي للرواشح.

ثم أعد تعليق الكريّة في 1 milliliter من الوسط الغذائي الكامل، وحدد عدد الخلايا الحية. إن عزل ومعالجة الخلايا المناعية كما تم توضيحه للتو، يوفر عدداً كافياً من الخلايا لإجراء تحفيز خارج الجسم (ex-vivo) وتوصيف أنماط إفراز السيتوكينات للخلايا اللثوية من كل من الحيوانات البرية (wild-type) والحيوانات القابلة للإصابة بالتهاب دواعم السن. وبالفعل، يمكن تحليل تركيب الخلايا المناعية اللثوية الفأرية كما هو موضح في مخططات الكثافة هذه التي تقيم مجموعات خلايا t والخلايا القاتلة الطبيعية في فئران LFA knockout القابلة للإصابة بالتهاب دواعم السن.

باستخدام استراتيجيات تحديد البوابات (gating) المناسبة، يمكن أيضاً تحديد إنتاج السيتوكينات داخل الخلايا في الخلايا التائية الموجبة لـ TCR beta CD4، والخلايا التائية الموجبة لـ TCR beta CD8، والخلايا التائية الموجبة لـ TCR gamma delta، بالإضافة إلى الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا اللمفاوية الفطرية. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن عزل الخلايا في غضون ثلاث ساعات لغرض التلوين المناعي إذا تم تنفيذ التقنية بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر إكمال جميع الخطوات بكفاءة وسرعة، مع إبقاء الخلايا على الثلج في أي وقت لا يتم فيه التعامل معها.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل فرز الخلايا، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بوظيفة المجموعات الخلوية الفرعية المحددة.