رني الزناد تسليم إلى

الهدف العام من هذه الطريقة هو إيصال محفزات تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference) في بعوض Anopheles gambiae لبدء تثبيط الجينات (gene knockdowns) التي تبدأ خلال مرحلة العذراء من التطور. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا النواقل والكشف عن الجينات التي تلعب دوراً خلال المراحل التنموية ما قبل البلوغ أو المراحل البالغة المبكرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمنح الباحثين فرصة لإجراء دراسات جينومية وظيفية سريعة، من خلال بدء تثبيط الجينات خلال الفترة التنموية، وهي مرحلة العذراء، حيث لم تكن بروتوكولات حقن تداخل الحمض النووي الريبي قد طُبقت سابقاً.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الحقن قد يكون من الصعب إتقانها نظراً للدقة المطلوبة والطبيعة الحساسة للعذراء خلال هذه المرحلة التطورية. بعد اختيار الجين المستهدف، حدد منطقة تتراوح بين 200 إلى 800 زوج قاعدي من المتوقع ألا يكون لها تأثيرات خارج الهدف، وأجرِ تضخيماً قياسياً بتقنية PCR للحصول على قالب تخليق RNA مزدوج الشريط محاط بتسلسل محفز T7. ثم قم بتخليق RNA مزدوج الشريط وتنقية النواتج باستخدام طقم تجاري للتخليق في المختبر (in vitro).

اضبط التركيز النهائي لـ RNA ليكون 3 µg/µL. بعد ذلك، استخدم هلام أجاروز قياسي بتركيز 2% لمقارنة 0.5 µL من الـ RNA مزدوج السلسلة مع الـ DNA القالب والعلامات القياسية. وبمجرد اكتمال عملية الفصل الكهربائي، تحقق من جودة وطول حزمة الـ RNA مزدوج السلسلة.

يجب ألا تظهر أي نواتج غير محددة. سيهاجر الـ RNA مزدوج الشريط بشكل أبطأ من الـ DNA القالب. وللتخزين، يتم تحضير حصص مقسمة من الـ RNA مزدوج الشريط وحفظها عند درجة حرارة -20 °C.

ابدأ بتحضير صبغة Fast Green FCF. أولاً، قم بتخفيف الصبغة إلى 0.1% حجماً بالنسبة للحجم في ماء خالٍ من RNase. بعد ذلك، انقل أحجام قدرها 1 µL من المحضّر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL.

سخن الأنابيب المملوءة عند 65 °C لمدة ثلاث ساعات تقريبًا لتبخير الماء. ثم برد الأنابيب لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل استخدام مواد الصبغة الصلبة. بعد ذلك، جهز إبر حقن زجاجية مسحوبة من أنابيب زجاج البوروسيليكات.

اضبط ساحب الإبر للحصول على قطر طرف يتراوح بين 10 إلى 30 ميكرون. بالنسبة لساحب الشعيرات من نوع NARISHIGE، اضبط السخان الأول على 100، والسخان الثاني على 70. بعد ذلك، قم بتثبيت الإبرة الشعرية، ثم ابدأ بعملية السحب.

الآن، قم بتجهيز محطة الحقن. اختر منصة يمكن تحريكها بسهولة تحت المجهر. قم أولاً بتثبيت ورقة ترشيح سميكة على المنصة باستخدام شريط لاصق.

بعد ذلك، قم بتثبيت ورقة ترشيح رقيقة واحدة فوق ورقة الترشيح السميكة باستخدام شريط لاصق. تالياً، أضف 10 µL من كل RNA مزدوج السلسلة المراد حقنه إلى أنابيب صبغة التحميل، وأعد تعليق الصبغة. احفظ هذه الأنابيب على الثلج.

الآن، قم بجمع العذراء المراد حقنها. املأ طبق بتري بقطر 60 مليمتر بـ 10 مليلتر من الماء منزوع الأيونات، وانقل حوالي 50 عذراء فاتحة اللون إلى الطبق باستخدام ماصة نقل بلاستيكية. استخدم فقط العذراء ذات الصبغة الخفيفة، لأن العذراء التي وصلت بالفعل إلى مستويات تسمير متوسطة إلى داكنة ستتعرض لتلف في القشيرة، وستكون معدلات بقائها ضعيفة.

تتمثل الخطوة الأولى في عملية الحقن المجهري في فتح الإبرة. تحت المجهر، قم بكسر الطرف القاصي جداً للإبرة باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك، قم بتعبئة الإبرة عكسياً بالزيت المعدني باستخدام سرنجة وإبرة قياس 30 gauge.

بمجرد التعبئة، قم بطرد الزيت الزائد باستخدام المحقن الدقيق. اضبط المحقن الدقيق لسحب أحجام قدرها 69 nanoliter. بعد ذلك، قم بتعبئة مقدمة الإبرة بـ RNA الحقن المُحضّر.

اختبر عملية توزيع الـ RNA مزدوج السلسلة للتأكد من خلوها من المشكلات. ويُعد انسداد الطرف أو عدم تثبيت الإبر بشكل محكم المصدرين الرئيسيين للمشكلات. وبمجرد تجهيز الحاقن، اختر من خادرة واحدة إلى ثلاث وخُدها إلى مرحلة ورق الترشيح.

باستخدام فرشاة رسم، قم بتوجيه الخادرة بحيث تكون القشيرة الظهرية متاحة. وعند الضغط على الورق، سيتم امتصاص الماء الزائد من الخادرة. ومع تثبيت الخادرة باستخدام فرشاة رسم مبللة، استخدم حركة من الأمام إلى الخلف لإدخال الإبرة في القشيرة الظهرية بين البطن والصدر، بزاوية تبلغ 30 درجة تقريبًا.

بعد ذلك، يتم حقن نبضة واحدة أو نبضتين من الحمض النووي الريبي مزدوج السلاسل (double-stranded RNA) في الدم اللمفاوي (hemolymph). ويجب أن يكون انتشار الصبغة في جميع أنحاء الجسم مرئياً في حال نجاح عملية الحقن. وأثناء حقن العذراء، من الضروري ألا تخترق الإبرة سوى القشيرة الظهرية.

إذا امتد ثقب الإبرة عبر القشيرة البطنية، فسيظهر تجمع للسائل المصبوغ على السطح الخارجي للعذراء، أو سينتقل الصبغ إلى ورقة الترشيح. في هذه الحالات، يجب التخلص من العذراء. أما إذا لم يتوزع الصبغ في جميع أنحاء الهيموليمف، فمن المرجح أن تكون طرف الإبرة مسدودة.

حرك طرف الإبرة قليلاً وتحقق مما إذا كان هناك أي تحرر لـ RNA والصبغة. إذا لم يظهر أي مؤشر على تحرر الصبغة، تخلص من الخادرة. بعد ذلك، قم بتقييم طرف الإبرة وأجرِ عملية حقن أخرى في خادرة جديدة.

بعد حقن العذراء بنجاح، استخدم فرشاة تلوين مبللة لتحريرها برفق من الإبرة، ثم انقلها إلى طبق يحتوي على الماء حيث ستكمل عملية النمو. ضع طبق العذارى المحقونة في قفص أو حاوية بعوض تحت ظروف التربية الطبيعية. ولتوفير مصدر غذاء للبعوض البالغ، قدم الجلوكوز في محلول بتركيز 10% وزن/حجم مشرب في كرة قطنية.

بعد ظهور الحشرات البالغة، قارنها بمجموعات الضبط. على سبيل المثال، يجب تقييم الحشرات ذات الـ SRPN2 مزدوج الشريط يومياً للكشف عن تشكّل الأورام الكاذبة. وللقيام بذلك، قم بتبريد الحشرات البالغة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند درجة حرارة -20 °C، ثم انقلها إلى لوح تبريد عند درجة حرارة 2 °C للفحص.

بعد فحص الحشرات البالغة، أعدها إلى منطقة تربية الحشرات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، ظهرت الحشرات البالغة من العذارى المحقونة بنسبة بلغت حوالي 70%. وفي مجموعة فرعية من العذارى المحقونة، حدث خروج جزئي من شرنقة العذراء، مما أدى إلى إنتاج بعوض غير قابل للحياة. ولم يكن هناك أي تأخير في معدلات الخروج بين البعوض المحقون وغير المحقون، كما أن آثار الحقن لم تختلف باختلاف الجنس.

بعد عشرة أيام من الخروج من الشرنقة، لم يكن هناك تغير ملحوظ في معدل بقاء البعوض المحقون مقارنة بمجموعات الضبط غير المحقونة. استُخدم مثبط السيرين بروتياز، SRPN2، كضابط موجب، بينما استُخدم LacZ مزدوج السلسلة كضابط سالب لعمليات حقن الرنا مزدوج السلسلة. وبحلول اليوم الثالث بعد الخروج من الشرنقة، ظهرت الأورام الكاذبة في البعوض البالغ المحقون بـ SRPN2 مزدوج السلسلة بوضوح عبر المجهر الضوئي.

بعد ثمانية أيام، أصبحت الأورام الكاذبة بارزة جداً. وفي البعوض في مرحلة البلوغ، أمكن ملاحظة أورام كاذبة ميلانية من خلال كيوتيكل معظم الحيوانات التي حُقنت بـ SRPN2 مزدوج السلسلة، بينما لم تظهر أي أورام كاذبة في مجموعات الضبط. وبعد خمسة أيام من الحقن، كانت مستويات بروتين SRPN2 أقل بشكل ملحوظ في البعوض المحقون بـ SRPN2 مزدوج السلسلة، مقارنة بمجموعات الضبط المحقونة بـ LacZ مزدوج السلسلة ومجموعات الضبط غير المحقونة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تنفيذ عملية توصيل محفز تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference) إلى خادرة بعوضة Anopheles gambiae، باستخدام بروتوكول الحقن المطور حديثاً هذا. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة بسبب الحركة غير المتوقعة للخادرة. ومع ذلك، فإن التدرب على التموضع الصحيح وتثبيت الخادرة يعزز بشكل كبير معدل نجاح الحقن، فضلاً عن جودة الحقن.

بمجرد إتقان هذه التقنية، تتطلب هذه الحقنات حوالي 30 ثانية لكل عذراء. ومن خلال تطوير هذه التقنية، فقد مهدنا الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا النواقل لاستكشاف وتقييم وظيفة الجينات خلال مراحل النمو ما قبل البالغة وبداية مرحلة البلوغ في ناقل الملاريا Anopheles gambiae. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل Western blot أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) لتحديد مدى تثبيط الجين المستهدف على مستوى تعبير البروتين أو النسخ، على التوالي.

في نهاية المطاف، يمكن لهذه التقنية أن تساعد في تحديد الجينات الضرورية لانتقال الطفيليات بواسطة البعوض، كما سيساعدنا هذا النهج في تحديد أهداف جديدة وتقديم رؤى جديدة حول كيفية إنشاء استراتيجيات أكثر فعالية لمكافحة النواقل.