المناعية الفوسفات-الحواتم في مهدبة هيئات الجامع جبل الزرد الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إضفاء الطابع المناعي على البروتينات التي يتم تنشيطها في جنين الزرد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النمو والخلية ، مثل توطين وتنشيط البروتينات الفسفرية في جنين كامل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء توطين الإشارات المعتمدة على الكالسيوم في جنين كامل عن طريق تلطيخ البروتينات المناعية التي يتم تنشيطها بواسطة الكالسيوم.

بعد الحصول على أجنة من النوع البري أو المعدلة وراثيا وفقا لبروتوكول النص ، أضف 0.003٪ PTU إلى الأجنة في ماء النظام لمنع التصبغ واحتضانه إلى مرحلة النمو المطلوبة. عندما تصل الأجنة إلى المرحلة الصحيحة ، أضف MESAB إلى الطبق لتخدير السمك. بمجرد تخدير الأسماك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من ماء النظام ، ثم أضف 4٪ PFA و PBS الطازج واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.

بعد الحضانة ، قم بإزالة PFA واستخدم 100٪ من الميثانول لاستبداله. ثم قم بتخزين الأجنة عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. لإجراء التلوين المناعي ، ضع ما لا يقل عن 10 أجنة لكل حالة تجريبية في أنابيب طرد مركزي دقيقة مسمى 1.5 ملم.

عندما تستقر الأجنة في قاع الأنبوب ، قم بإزالة الميثانول والتخلص منه واستخدم الغسيل التدريجي لتركيزات الإيثانول المتناقصة في PBTx لإعادة ترطيب الأجنة. قم بإزالة آخر غسول PBTx وأضف 0.5 مل من مصل الماعز العادي بنسبة 10٪ أو NGS في PBTx. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل مع هزاز لطيف.

بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول وأضف 0.2 إلى 0.5 مل من تخفيف 1 في 5 من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للأستيلات و10٪ NGS و PBTx. احتضان الأجنة بهزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في الصباح ، قم بإزالة الجسم المضاد والتخلص منه وقم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 0.5 مل من 2٪ NGS و PBTx مع هزاز لطيف لمدة خمس دقائق لكل منهما.

قم بتعتيم المصابيح العلوية وأضف 500 ميكرولتر إلى كل عينة من تخفيف 1 في 500 من الجسم المضاد الثانوي المترافق بشكل فلوري في 10٪ NGS و PBTx. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات مع هزاز لطيف. بعد الحضانة ، اغسل الأجنة ثلاث مرات.

للمشاركة في المناعة ، أضف 1 في 20 من الجسم المضاد CaMKII المضاد للفوسفو. احتضن في الظلام مع هزاز لطيف طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، بعد غسل الأجنة ب 2٪ NGS و PBTx ثلاث مرات ، أضف 1 في 5 تخفيف من الماعز المترافق الفلوري الأحمر 568 IgG و 10٪ NGS و PBTx.

بعد الحضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، اغسل الأجنة ثلاث مرات واحفظها في PBTx أو 50٪ جلسرين في PBS اعتمادا على إجراء التصوير. لتركيب الأجنة للتصوير ، ضع أجنة إلى خمسة أجنة على شريحة زجاجية. استخدم أربعة أجزاء من انزلاق الغطاء المكدس رقم واحد على جانبي السمكة لإنشاء غرفة.

ووضع زلة غطاء في الأعلى. مع عدسة الغمر بالزيت 100X والضوء المنقول ، قم بتركيز جنين واحد. أطفئ الضوء.

قم بتشغيل المجهر متحد البؤر باستخدام الليزر المناسب وقم بتشغيل التركيز عن بعد. افتح البرنامج متحد البؤر وفي شريط الاستحواذ ، حدد الهدف المناسب. ثم ، في الشريط الأساسي XY ، انقر فوق الزر 1024 لتعيين حجم الصورة.

في شريط الليزر والكاشف ، انقر فوق المربعين 488 الأحمر والأخضر 568 لتشغيل كاشف الليزر لكل قناة وضبط الثقب على متوسط. ثم ، في شريط الكسب ، اضبط الكسب لكل قناة لتصورها. بعد ذلك ، في شريط إعدادات الاكتساب ، انقر فوق مباشر لبدء الحصول على الصور.

في شريط إعدادات العرض، قم بإلغاء تحديد مربع التكبير/التصغير المتكامل لفرض التوسيط في النافذة المباشرة. في شريط إعدادات الحصول أسفل علامة التبويب Z ، انتقل عبر طبقات الصورة. بعد تحديد عدد الطبقات المراد دمجها في الصورة ، انتقل إلى نقطة ما في وسط المستوى Z.

ضمن علامة التبويب Z ، انقر فوق المربع المرجعي الأحمر الصغير. سيؤدي هذا إلى تصفير RFA عند النقطة المختارة كمركز. في المربع المسمى حجم الخطوة، حدد سمك الطبقات.

انتبه إلى مربع حجم الملف وحاول قصر الملفات على غيغابايت واحد. للعثور على الطرف العلوي للصورة ، انقر فوق الدائرة الموجودة بجوار الأعلى وانتقل عبر طبقات Z. انقر الآن فوق الدائرة الموجودة بجوار الأسفل وسيقوم الكمبيوتر بإعادة الصورة إلى الطبقة كمركز.

ثم ، في مربع إعدادات الاكتساب ، انقر فوق مباشر مرة أخرى لإيقاف الاستحواذ على الليزر. في هذه اللوحة ، انقر فوق المربعات الحمراء المسماة متوسط و Z stack. ستتحول هذه الصناديق إلى اللون الأخضر.

في مربع إعدادات الاكتساب ، انقر فوق واحد للحصول على سلسلة الصور بأكملها. راقب التقدم أثناء المسح الضوئي في كلتا القناتين ومن خلال مكدس Z بأكمله. للحفظ ، انقر فوق نافذة وحدة التخزين وانقر فوق حفظ باسم وقم بتسمية الملف.

لعرض الملف بحجم ، بينما لا يزال مكدس Z مفتوحا ، حدد القائمة المنسدلة للبيانات وانقر فوق عرض وحدة التخزين. احفظ الملف المعروض كملف dot tif. يوضح هذا الشكل تلطيخ مناعي ل P-CaMKII والتوبولين الأسيتيل ، وهو علامة قياسية للأهداب في حويصلة Kuppfer أو KV. تولد تغذية الأهداب الأولية تدفقا دائريا للسوائل ، مما يؤدي إلى ارتفاع الكالسيوم في الخلايا المهدبة المبطنة ل KV وتنشيط CaMKII في مواقع منفصلة كما هو موضح هنا.

تظهر هذه الأشكال P-CaMKII كما يظهر على السطح القمي للخلايا المهدبة التي تبطن مناطق معينة من القنوات العجانية بين 24 و 72 ساعة بعد الإخصاب أو HPF. في يوم واحد من التطور ، تحتفظ الأذن الجنينية لسمكة الزرد المثبتة ب PFA والميثانول بهياكلها وتسمح باكتشاف تلطيخ CaMKII في القاعدة وعلى طول kinocilum. في 72 HPF ، تم تلطيخ الأذن الداخلية ب Alexa 488 phalloidin والتوبولين المضاد للأسيتيل مع Alexa 568.

تثبيت الميثانول PFA على كل من F-actin و tubulin. عبرت أسماك HPF البالغ عددها 30 سمكة عن GFP مستهدف الغشاء ، والذي سيفقد مع تثبيت الميثانول. أدى تثبيت PFA إلى تناقص إشارة P-CaMKII مقارنة بالتثبيت مع PFA والميثانول.

ومع ذلك ، في هذه المرحلة من التطوير ، تكون الإشارة قوية بما يكفي ليتم اكتشافها بدون الميثانول. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام أجنة جديدة وعوامل حرة جديدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توطين البروتينات الفوسفورية في أجنة الزرد.