القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

الهدف العام من هذه التجربة هو قياس ديناميكيات الأكتين القشري كمياً عن طريق مطيافية ارتباط الصور بعد التصوير باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي، أو التصوير بالإضاءة المهيكلة، أو turf sim. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال الفيزيائي الحيوي، مثل الدور الذي يلعبه تدفق الأكتين القشري في تنظيم التفاعلات عند التشابك المناعي. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تجمع بين الدقة على مقياس النانومتر والتوافق مع الظروف الحيوية، مما يسمح بمراقبة وتحليل عمليات على نطاق أصغر مقارنة بتقنيات المجهر التقليدية.

سيقوم بجوارج أشداون، وهو طالب دكتوراه من مختبري، بتطبيق هذه التقنية. بالنسبة للعينة الاختبارية، أضف 5 µL من محلول مخزني لكرات مجهرية فلورية ذات قطر 100 nm تحت حد الحيود على سطح شريحة غطاء غير مطلية وحديثة. ثم قم بتوزيع محلول الكرات المجهرية على شريحة الغطاء باستخدام رأس ماصة واتركها لتجف.

أضف 200 µL من وسط التثبيت إلى شريحة الغطاء الاختبارية للتحضير لبدء التصوير، ثم قم بتشغيل الحاضنة لسخان المنصة في نظام turf SIM واملأ الخزان بالماء المقطر لتغطية قاعدة عنصر التسخين بالكامل. اترك الماء ليتوازن عند 37 °C. قم بتوصيل طوق التسخين بالعدسة الشيئية واضبطه على 37 °C.

ثم قم بتثبيت كتلة التدرج المتوافقة مع turf 4 88 في مسار الضوء للمجهر لضمان تفعيل المسار البصري الصحيح. قم بتحويل وضع القناة في قاعدة الليزر إلى الوضع المنفرد. كرر هذا الإجراء بالنسبة لكابل الألياف الموجود على منصة المجهر.

توقع ظهور خطأ في نافذة البرنامج إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوات. بعد ضبط الوضع، اخفض العدسة الشيئية إلى أدنى مستوى للمستوى Z وضع قطرة من الزيت عليها. ضع شريحة الغطاء الخاصة بالعينة المختبرة التي تحتوي على الكرات المجهرية الفلورية على منصة المجهر.

بعد ذلك، اختر نظام التركيز المثالي (perfect focus system) أو وظيفة PFS الموجودة على جسم المجهر. حرك الشيئية تدريجياً للأعلى عبر المستوى Z وتوقف عندما يتوقف زر PFS عن الوميض، مما يشير إلى الوصول إلى المستوى البؤري في برنامج التحكم. انتقل إلى العرض المباشر (live view) لتصوير الكرات المجهرية على الشاشة.

أجرِ تعديلات دقيقة على التركيز باستخدام عجلة جهاز التحكم الدقيق PFS. لاحظ وجود إضاءة منتظمة دون أي انبعاث فلوري خارج نطاق التركيز فوق طول موجي قدره 75 nanometer. وأخيراً، تأكد من تحقيق الإضاءة المهيكلة من خلال ملاحظة نمط إضاءة متذبذب من عينة الكرات الدقيقة الفلورية لتحفيز الخلايا T في غرف ثمانية.

قم بتغطية شريحة الغطاء بـ 200 µL من خليط الأجسام المضادة anti CD3 و anti CD28، ثم حضّن شريحة الغطاء لمدة ساعتين عند 37 °C. بعد غسل شريحة الغطاء كما هو موضح في البروتوكول النصي، ضعها على منصة المجهر ثم حدد المستوى البؤري للسطح. بعد ذلك، قم بنقل 200 µL من الخلايا التائية (T cells) المنقولة جينياً برفق باستخدام الماصة إلى إحدى الآبار الموجودة على شريحة الغطاء.

استخدم الفلورية فوق البؤرية (epi fluorescence) لتتبع الخلايا المنقولة بـ GFP actin أثناء استقرارها على غطاء الشريحة. بمجرد استقرار الخلايا، انتقل إلى وضع التصوير الحي باستخدام N SimPad وتحقق من أن الخلايا تظهر بوضوح (في بؤرة التركيز) على الشاشة. لتسجيل سلسلة زمنية، افتح نافذة استحواذ ND واختر علامة تبويب الوقت (time tab).

ثم انقر فوق "إضافة" واضبط الفاصل الزمني على "بدون تأخير". واضبط المدة على 10 minutes. وأخيراً، ابدأ في تسجيل البيانات عن طريق اختيار "تشغيل الآن" في نافذة استحواذ ND.

لإعادة بناء الصور، افتح أولاً برنامج التحليل الذي يحتوي على وحدة التحليل المناسبة. انقر فوق التطبيقات (applications) ثم اختر نافذة عرض end sim. اضبط تباين تعديل الإضاءة (illumination modulation contrast) وقمع الضوضاء عالي الدقة (high resolution noise suppression) على القيمة واحد، ثم قم بإعادة بناء مجموعة بيانات turf SIM لإنتاج صورة SIM كاملة من شريط حالة الصورة.

تأكد من أن حجم البكسل هو 30 nanometers، ثم قم بتصدير البيانات كملفات TIF من أجل تحليل sticks. بعد تحميل وفك ضغط حزمة برمجيات sticks MATLAB، افتح السكريبت. ثم حدد معاملات الإدخال كما هو موضح في البروتوكول النصي لمرشح إزالة الجسيمات غير المتحركة.

في السطر 23، قم بضبط معامل التصفية على المتوسط المتحرك (moving average)، وفي السطر 24، استخدم القيمة 21 كمعامل للمتوسط المتحرك لإنشاء خريطة متجهية واحدة. قم بضبط المنطقة الزمنية الفرعية في السطر 31 على الحد الأقصى لعدد الإطارات، وهو 63 في هذه الحالة. ثم في السطر 32، اضبط الإزاحة الزمنية على واحد في الأسطر من 33 إلى 35.

أدخل أسماء ملفات المخرجات، وعناوين خرائط الناقلات الناتجة، ومسار دليل المخرجات. ثم حدد التنسيق الذي يجب حفظ صور خريطة الناقلات به؛ وفي هذه الحالة، png.

في نافذة محرر MATLAB، افتح السكريبت. قم بتشغيل "run one channel sticks" وتحميل سلسلة الصور عن طريق تنفيذ السطور من 1 إلى 23 من السكريبت. بعد ذلك، قم بتشغيل السطور من 29 إلى 35 من "run one channel sticks".

لبدء تحليل العيدان، اتبع الإرشاد وحدد مضلعاً لتعريف منطقة الاهتمام أو ROI إذا كنت ترغب في ذلك. لعرض خرائط المتجهات، قم بتشغيل السطور من 38 إلى 52. ثم قم بتشغيل السطور من 53 إلى 72 لرسم المخطط التكراري لمقدار السرعة؛ الموضح هنا هو OT T-cell يعبر عن GFP وموسوم بـ F actin، وقد تم تصويره باستخدام بروتوكول turf sim.

تمت مناقشته في النص بعد خمس دقائق من وضع هذه الخلية على شريحة غطاء مغلفة بالأجسام المضادة anti CD3 و anti CD28 بهدف تحفيز تكوين المشابك المناعية. وقد تم تسجيل تسلسل زمني لها بحيث يمكن تصور التدفق الجزيئي لـ f actin. وقد مكن التحليل اللاحق لهذه البيانات باستخدام برنامج this sticks من قياس التدفق الجزيئي لـ F actin كما هو موضح في خريطة المتجهات هذه التي تقابل المنطقة المحددة في الخلية على اليسار، والتي تمثل جزءاً من محيط المشبك.

يؤدي تكبير هذه الخريطة والمنطقة الفرعية للخلية التائية إلى توضيح اتجاه وسرعة تدفق الأكتين، والتي يمكن تحديدها من طول المتجه بالإضافة إلى الرمز اللوني. كما يمكن رسم بيانات السرعة في مدرج تكراري للسماح بالتحليل الإحصائي. وبشكل جماعي، تظهر هذه النتائج أنه في المشبك المناعي، يتدفق F actin بطريقة متماثلة من المحيط باتجاه مركز الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية الحصول على بيانات ts وتحليل ديناميكيات الأكتين القشري باستخدام مطيافية ارتباط الصور.

على الرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لاكتساب رؤى حول تدفق الأكتين أثناء هجرة الخلايا التائية، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً في أنظمة أخرى يُعتقد أن التدفق الجزيئي فيها مهم، مثل دراسة هجرة الخلايا.