القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد ديناميكيات الأكتين القشري عن طريق التحليل الطيفي لارتباط الصورة بعد الاستحواذ عن طريق الانعكاس الداخلي الكلي أو تصوير الإضاءة الهيكلية أو محاكاة العشب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الفيزيائي الحيوي ، مثل الدور الذي يلعبه تدفق الأكتين القشري في تنظيم التفاعلات في المشبك المناعي. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تجمع بين دقة مقياس النانومتر وتوافق نمط الحياة ، مما يسمح بمراقبة العمليات الأصغر حجما وتحليلها مقارنة بتقنيات الفحص المجهري التقليدية.

سيظهر هذه التقنية جورج أشداون ، طالب دكتوراه من مختبري. للحصول على عينة اختبار ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول مخزون الكرة المجهرية الفلورية الفرعي الحيود بقطر 100 نانومتر إلى سطح زلة غطاء جديدة غير مطلية. ثم انشر محلول الكرة المجهرية على زلة الغطاء بطرف ماصة واتركه حتى يجف.

أضف 200 ميكرولتر من وسيط التركيب إلى زلة غطاء الاختبار للتحضير للتصوير لبدء تشغيل الحاضنة لسخان المرحلة لنظام SIM العشب وملء الخزان بالماء المقطر لتغطية قاعدة عنصر التسخين بالكامل. دع الماء يتوازن إلى 37 درجة مئوية. قم بتوصيل طوق التسخين بالعدسة الموضوعية واضبطه على 37 درجة مئوية.

ثم قم بتأمين كتلة التدرج المتوافقة مع العشب 4 88 في مسار الضوء للمجهر لضمان تعشيق المسار البصري الصحيح. قم بتبديل وضع القناة على سرير الليزر إلى الوضع الفردي. كرر هذا الإجراء لكابل الألياف على مرحلة المجهر.

توقع رؤية خطأ في نافذة البرنامج إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوات. بعد ضبط الوضع ، قم بخفض الهدف إلى أدنى مستوى Z وضع قطرة من الزيت عليه. ضع زلة غطاء عينة الاختبار مع الكريات المجهرية الفلورية على مرحلة المجهر.

ثم حدد نظام التركيز المثالي أو وظيفة PFS على جسم المجهر. حرك الهدف تدريجيا لأعلى عبر المستوى Z وتوقف عندما يتوقف زر PFS عن الوميض ، مما يشير إلى أنه تم الوصول إلى المستوى البؤري على برنامج التحكم. قم بالتبديل إلى العرض المباشر لتصوير الكريات المجهرية على الشاشة.

قم بإجراء تعديلات دقيقة على التركيز باستخدام عجلة مناور PFS الصغيرة. راقب إضاءة موحدة مع عدم وجود إرسال فلوري خارج نطاق التركيز فوق موجة الرائحة البالغة 75 نانومتر. أخيرا ، تأكد من تحقيق الإضاءة الهيكلية من خلال مراقبة نمط إضاءة متقلب من عينة الكرة المجهرية الفلورية لتحفيز الخلايا التائية التي تتعامل مع غرف الثمانية.

بتغطية البئر مع 200 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط ثلاثة ومضاد للقرص المضغوط 28 واحتضان زلة الغطاء لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد غسل زلة الغطاء كما هو موضح في بروتوكول النص ، ضعه على مرحلة المجهر ثم ابحث عن المستوى البؤري للعشب. بعد ذلك ، قم بوضع 200 ميكرولتر من الخلايا التائية المنقولة برفق في أحد الآبار الموجودة على زلة الغطاء.

استخدم مضان epi لتتبع الخلايا المنقولة بالأكتين GFP أثناء هبوطها على زلة الغطاء. بمجرد استقرار الخلايا ، قم بالتغيير إلى الوضع المباشر باستخدام N SimPad وتحقق من أن الخلايا الموجودة على الشاشة في بؤرة التركيز. لتسجيل دورة زمنية ، افتح نافذة اكتساب ND وحدد علامة التبويب الوقت.

ثم انقر فوق إضافة واضبط الفاصل الزمني على عدم تأخير. اضبط المدة على 10 دقائق. أخيرا ، ابدأ في تسجيل البيانات عن طريق تحديد تشغيل الآن في نافذة اكتساب ND.

لإعادة بناء الصور ، افتح أولا برنامج التحليل الذي يحتوي على وحدة التحليل الصحيحة. انقر فوق التطبيقات ثم حدد نافذة إظهار نهاية sim. اضبط تباين تعديل الإضاءة وقمع الضوضاء عالي الدقة على واحد وأعد بناء مجموعة بيانات بطاقة SIM العشب لإنتاج صورة SIM كاملة من شريط حالة الصورة.

تأكد من أن حجم البكسل هو 30 نانومتر ، ثم قم بتصدير البيانات كملفات TIF لتحليل العصا. بعد تنزيل حزمة برامج MATLAB واستخراجها ، افتح البرنامج النصي. ثم حدد معلمات الإدخال كما هو موضح في بروتوكول النص لمرشح إزالة غير المتحرك.

في السطر 23 ، قم بتعيين معلمة التصفية على المتوسط المتحرك وفي السطر 24 ، استخدم 21 كمعلمة متوسط الحركة لإنشاء خريطة متجه واحدة. اضبط المنطقة الفرعية الزمنية في السطر 31 على الحد الأقصى لعدد الأرتال في هذه الحالة 63. ثم في السطر 32 ، اضبط التحول الزمني على واحد في الأسطر من 33 إلى 35.

أدخل أسماء ملفات الإخراج وعناوين خرائط متجهات الإخراج ومسار دليل الإخراج. ثم حدد التنسيق الذي يجب حفظ صور خريطة المتجه به. في هذه الحالة ، png.

في نافذة محرر MATLAB، افتح البرنامج النصي. قم بتشغيل عصي قناة واحدة وقم بتحميل سلسلة الصور عن طريق تشغيل الأسطر من واحد إلى 23 من البرنامج النصي. بعد ذلك ، قم بتشغيل الأسطر من 29 إلى 35 من تشغيل العصي قناة واحدة.

لبدء تحليل العصا ، اتبع المطالبة وحدد مضلعا لتحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار إذا رغبت في ذلك. لعرض الخرائط المتجهة، قم بتشغيل الأسطر من 38 إلى 52. ثم قم بتشغيل الأسطر من 53 إلى 72 لرسم الرسم البياني لحجم السرعة الموضح هنا عبارة عن خلية OT T تعبر عن GFP المسمى F actin ، والتي تم تصويرها باستخدام بروتوكول sim العشب.

تمت مناقشته في النص بعد خمس دقائق من إدخال هذه الخلية على زلة غطاء مغلفة بالأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط الثالث والأجسام المضادة للقرص المضغوط 28 التي تهدف إلى تحفيز تكوين نقاط الاشتباك العصبي المناعية. تم أخذ دورة زمنية منه بحيث يمكن تصور التدفق الجزيئي للأكتين الصغير. مكن التحليل اللاحق لهذه البيانات باستخدام برنامج العصي هذا من القياس الكمي للتدفق الجزيئي F actin كما هو موضح في خريطة المتجه هذه المقابلة للمنطقة المعلبة للخلية على اليسار ، والتي تمثل جزءا من محيط المشبك.

يوضح التكبير الإضافي لهذه الخريطة والمنطقة الفرعية للخلية التائية اتجاه تدفق الأكتين وسرعته ، والتي يمكن تحديدها من طول المتجه بالإضافة إلى رمز اللون ، ويمكن أيضا رسم بيانات السرعة في رسم بياني يسمح بالتحليل الإحصائي. بشكل جماعي ، تظهر هذه النتائج أنه في المشبك المناعي F يتدفق الأكتين بطريقة متناظرة من المحيط باتجاه مركز الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية الحصول على ts في البيانات وتحليل ديناميكيات الأكتين القشرية باستخدام التحليل الطيفي لارتباط الصورة.

على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لاكتساب نظرة ثاقبة لتدفق الأكتين أثناء هجرة الخلايا التائية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا في أنظمة أخرى يعتقد أن التدفق الجزيئي مهم فيها ، مثل القيام بهجرة الخلايا.