Name: تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: اكتشف تحليل LINE-1 Retrotransposition على مستوى النواة الواحدة باستخدام تقنية FISH في خلايا HepG2. تتيح هذه الطريقة تقييم دقيق لمعدلات وأنماط الانتقال العكسي الجينومي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (ES014443 و ES017274) و AstraZeneca إلى KSR.

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يرجى الرجوع إلى قسم الكواشف حصول على تفاصيل حول كيفية تحضير الكواشف الفردية. 1. التعريف L1 تحقيقات ملاحظة: المسابر يمكن أن توصف بوصف الكيميائي أو PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العلامات الكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل جل الاغاروز 0،7-1٪ في تريس، خلات-EDTA (تاي) العازلة، الحرارة في الميكروويف حتى يذوب، والسماح للهلام لتبرد ثم قم بإضافة إيثيديوم بروميد (0.5 ميكروغرام / مل). تصب في صينية هلام، إضافة أمشاط، والسماح للهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية التحقيق SNeo (1-2 ميكروغرام) مع CY3 أو FITC عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: SNeo يدل على S pliced ​​الجدد الجينات mycin أعرب بعد دورة كاملة من retrotransposition. وهذا التحقيق هو ~ 1000 BP في الحجم. SNeo يمكن PCR تضخيمها من أي ناقل أو من genomجيم الحمض النووي. انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن Streptavidin-CY3 / FITC الكواشف وضع العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط SNeo حل المسبار المسمى العازلة مع 1X الحمض النووي تحميل، تحميل في كل بئر وتشغيلها في 75-100 فولت لمدة 15-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الفرقة التحقيق باستخدام-الأشعة فوق البنفسجية (UV) المنور. لاحظ أن حجم التحقيق SNeo يمكن تعديلها وقفل نوى حمض (LNA) ويمكن أيضا أن تضاف (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع صفت SNeo المسبار من هلام بشفرة نظيفة، إذابة وتنقية التحقيق SNeo من الجل باستخدام مجموعة PCR تنظيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنبيه: تغطية كل جزء المكشوفة من الجسم مع الدروع الواقية (أي، معاطف المختبر والأشعة فوق البنفسجية واضح قناع الوجه) عند عرض وقطع هلام. انظر الجدول من المواد والكواشف للمعلومات إلى هلام تنقية المنتجات PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع SNeo التحقيق وصفت الامم المتحدة على هلام الاغاروز 0.7٪ (انظر 1.1.1) لخداعزيادة حجم الشركة وفقدان كثافة إشارة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر، وتمييع التحقيق SNeo إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا 2 O. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR وصفها (طريقة بديلة لوضع العلامات التحقيق) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين SNeo الاشعال محددة (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &quot;و 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3 &#39;) مع الكواشف PCR في أنبوب واحد: 13.6 ميكرولتر نوكلياز مجانا H 2 O؛ 0.1 dATP ميكرولتر، dCTP، dGTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dTTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dUTP البيوتين / dUTP-FITC / CY3 (10 نانومتر)؛ 4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية 5X العازلة؛ 0.4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية البلمرة. قالب SNeo 1 ميكرولتر (10 نانوغرام). انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن الكواشف PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كمية من كل كاشف عن طريق ضرب من قبل عدد من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المعلمة الدراجات PCR التاليةالصورة لتضخيم والتسمية SNeo تحقيقات: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. ملاحظة: درجة الحرارة الصلب يمكن تعديلها أو يمكن الانتهاء التدرج PCR لتحديد درجات الحرارة الصلب المثلى لتحقيقات أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل جل 0،7-1٪ كما في القسم 1.1.1، تحميل ووضع تصور لفرقة التحقيق كما هو الحال في القسم 1.1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وتنقية SNeo التحقيق المسمى كما هو الحال في القسم 1.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع المسمى الامم المتحدة SNeo التحقيق لتأكيد زيادة حجم وفقدان كثافة إشارة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo التي كتبها الامتصاصية قياس في 260 نانومتر، وتمييع SNeo التحقيق إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا 2 O. </li></ol></li></ol> 2. إعداد ينتشر كروموسوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد الحيوانات المستنسخة مستقرة التعبير عن ناقلات العمود الفقري (كنترولل) أو retrotransposition L1 المختصة باستخدام منهجيات اختيار القياسية. 12،16 بينما استخدمت للصحفيين غير episomal لربط النتائج مع دراسات من النسخ، ويمكن أيضا أن تستخدم ناقلات episomal. تنمو الخلايا معربا عن ستابلي السيطرة أو ناقل L1 (1 × 10 6 خلايا في 10 سم لوحة، مع تعديلات في حجم لوحة مصنوعة حسب الحاجة) في وسائل الاعلام النمو الكامل. لخلايا HepG2، استخدم RPMI-1600، و 10٪ FBS و 200 ميكروغرام / مل من هيغروميسين. تنمو الثقافات إلى 70٪ التقاء عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. ملاحظة: إن اختيار المتوسطة النمو يعتمد على نوع من الخلايا. وبالنظر إلى أن البلازميدات المستخدمة هنا تحمل أشرطة اختيار كل من هيغروميسين والنيوميسين، ويمكن أيضا أن يتم اختيار مستقرة من الحيوانات المستنسخة مع النيومايسين بعد اختيارهم على هيغروميسين، ولكن المبلغ من النيوميسين يحتاج إلى أن يكون الأمثل لتحديد مستويات التسامح مع كل نوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة colcemid (0.4 ميكروغرام / مل) إلى مستنبت واحتضان لمدة 90 دقيقة لاعتقال الخلايا في metaphبورصة عمان. في حالة استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، تحديد تركيز الأمثل للcolcemid ووقت التعرض (60، 90، و 120 دقيقة) لاعتقال الطورية الأمثل تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 2X مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و(DPBS)، ويعرض للتريبسين بإضافة 3-5 مل من 0.25٪ التربسين حل للخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا. تعطيل التربسين مع مبلغ مساو من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونضح المتوسطة من الخلية بيليه وغسل الخلايا مع DPBS. نضح كل DPBS، وترك 200 ميكرولتر من DPBS لاعادة تعليق الخلايا. يتم خلط ضمان الخلايا بشكل جيد وأن جميع كتل متفرقة. استخدام الخفقان أو pipetting لطيف لخلط وتفريق كتل وتجنب vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من محلول منخفض التوتر (أي 75 ملي بوكل) التي هي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية قطرة من الحكمة في حين تناوب أنبوب 15 مل أفقيا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انظر الجدول المواد وReagenالخبر للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل حل ناقص التوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وكرر الخطوات من 2،4-2،5 3X ترك ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول منخفض التوتر لاعادة تعليق الخلايا بعد كل غسل. ضمان أنه في نهاية 3 يغسل، بيليه الأبيض بشكل واضح ومنتفخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من حل Carnoy تثبيتي، وجعل 1: 2، 1: 4، 1: 8، 01:16 التخفيفات في حل Carnoy مثبت. إسقاط 10 ميكرولتر من كل تخفيف على شريحة نظيفة وجافة من حوالي 1 سم فوق وفضح فورا الجانب خالية من انتشار لالبخار الساخن من الماء المغلي لمدة 30 ثانية. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل Carnoy مثبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف فروق في درجة حرارة الغرفة، وصمة عار مع 0.1 ميكروغرام / مل هويشت-33342 عن طريق الغمر لمدة 15-20 دقيقة في Coplin جرة وغسل 3X مع DPBS. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل هويشت-33342. </li> &lt;لى&gt; مشاهدة ينتشر في مضان المجهر / المرحلة على النقيض في 40X التكبير. بعد تحسين إعداد انتشار، ليس من الضروري أن تكون ملطخة ينتشر مع هويشت-33342. رأي ينتشر على المجهر مرحلة التباين في 10X التكبير لتحديد نوعية انتشار والانفصال كما هو موضح في قسم النتائج (انظر الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ودائرة هوامش جيدة مع نقطة علامة الماس على الجانب الآخر من الشريحة (أي نشر خالية من الجانب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر ينتشر في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر واحد. تجنب التعرض للرطوبة. </li></ol> 3. الإسفار في الموقع التهجين (FISH) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار والتجفيف ينتشر ينتشر يوازن الطورية كروموسوم إلى درجة حرارة الغرفة إذا المخزنة في -20 ° C: ملاحظة. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينتشر احتضان كروموسوم الطورية مع 200 ميكرولتر ريبونوكلياز ألف ل1 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح العازلة-2X SSC مرتين لمدة 5 دقائق كل تليها الشطف مع 10 ملي حل حمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ينتشر بنسبة 1٪ البيبسين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وشطف مع H 2 O منزوع الأيونات ويغسل مرتين مع العازلة-2X SSC لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ينتشر مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة ويغسل العازلة في SSC 2X مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى ينتشر عن طريق احتضان لمدة 2 دقيقة في سلسلة الايثانول: 70٪، 80٪، و 95٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح الهواء الجاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التهجين ينتشر مع L1 تحقيقات retrotransposition -labeled (أي SNeo) تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 نانوغرام من SNeo إلى عازلة التهجين، الحرارة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبارد لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من SNeo حل التحقيق إلى البريدانتشار منظمة العمل ضد الجوع، وتغطي مع ساترة وختم حواف مع الاسمنت والمطاط. ضمان عدم تشكيل فقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة الشريحة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة، وانخفاض تدريجي في درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة ترطيب المظلمة عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل وعرضها (أو إضافة الجسم المضاد الثانوي) تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات. ملاحظة: انظر جدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية إعداد. يوصى باستخدام كمية كافية لتغطية انتشار كروموسوم كامل. تذكر أن حجم الفائض سوف تضيع عند إضافة ساترة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح العازلة في SSC 2X لإزالة coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن-2X SSC في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح عن طريق الغمر في غسل العازلة في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 0.1X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 2X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: ضع جرة Coplin تحتوي عازلة الموصى بها في حمام مائي، وضبط درجة الحرارة إلى 45 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح باردة لدرجة حرارة الغرفة ويوازن الشرائح العازلة في الكشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيقات المسمى مباشرة، انتقل إلى الخطوة 3.4.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيقات المسمى غير المباشرة، كتلة في عرقلة العازلة لمدة 20-30 دقيقة ويغسل 3X في DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 5 ميكروغرام / مل streptavidin-FITC، أو αCY3 في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح في 2X SSC لمدة 5 دقائق مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين مع هويشت-33342 حل (0.1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: يتم ذلك تلطيخ وصمة عار الكروموسومات للمشاركة في توطين مع التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في DPBS 3X، إضافة قطرة من المتوسطة المتزايدة، وضع ساترة وختم حواف مع طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل L1 retrotransposition باستخدام المجهر مضان في 40X أماهgnification. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li>
<li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li>
<li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+LINE-1+reverse+transcriptase%3Aeffect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li>
<li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li>
<li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li>
<li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li>
<li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li>
<li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li>
<li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li>
<li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li>
<li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li>
<li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li>
<li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li>
<li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li>
<li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Gen+Develop%22%5BJournal%5D)">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li>
<li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li>
<li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li>
<li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li>
<li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li>
<li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li>
<li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المحتملة.

وقد تم توظيف منهجيات مثل تسلسل الجينوم بأكمله، معكوس PCR والنشاف جنوب لدراسة L1 retrotransposition. على الرغم من أن هذه المنهجيات هي قيمة للغاية في تحديد مكان وقوع الإدراج L1 داخل الجينوم، تحديا الخلط لجميع من لهم هو الحاجة إلى برمجة في سيليكون لإعادة تجميع متواليات. تم تصميم منهجية الأسماك وصفها هنا لتكمل هذه الطرق، خاصة في حالة الدراسات التي تتطلب تحليلات خارج الرحم retrotransposition L1 في الخلايا المستزرعة. النهج يمكن أن تستخدم في كل من التق...

الإنسان طويل تتخللها النووية العنصر 1 (الخط 1 أو L1) هو عنصر المنتقلة والمستقلة التي تنتشر داخل الجينوم من خلال &quot;نسخ ولصق&quot; آلية retrotransposition. وL1 الإنسان النموذجي هو ~ 6 كيلو بايت طويلة ويتكون من 5&#39;UTR (منطقة غير مترجمة) التي هي بمثابة المروج، إطارين القراءة المفتوحة (ORFS): L1 -ORF1 وL1 -ORF2، و3&#39;UTR مع بوليا . ذيل L1 البروتين -ORF1 ثلاثة مجالات مختلفة هي: مجال لفائف لفائف، RNA الاعتراف الحافز ونطاق C-محطة، بينما بروتين L1 -ORF2 ديه نوكلياز داخلية، عكس الناسخ والسيستين المجالات الغنية 1،2،3،4،5. L1 -ORF1 يسلك أنشطة حمض كوصي النووية، في حين يوفر L1 -ORF2 الأنشطة الإنزيمية، مع كل من البروتينات اللازمة لretrotransposition 1،2،6. دورة من L1 retrotransposition يبدأ النسخ من 5&#39;UTR من L1 </م&gt; مرنا bicistronic التي كتبها RNA البلمرة الثاني، النبات إلى السيتوبلازم، والترجمة. في السيتوبلازم، L1 -ORF1 المعارض إما -binding رابطة الدول المستقلة حيث حزم RNA الخاص بها أو -binding العابرة حيث حزم الرنا الأخرى (أي، جيب / SVAS / الكاذبة) لتشكيل الجسيمات بروتين نووي ريبوزي (RNP) مع L1 -ORF2p 7، 8. RNPs نقل من داخل النواة حيث النشاط نوكلياز داخلية من النكات L1 -ORF2p الحمض النووي الجيني (gDNA) للكشف على OH - مجموعة 9، التي هي بدورها تستخدم من قبل الناسخ العكسي لرئيس الوزراء وعكس توليف الحمض النووي الريبي على الحمض النووي من نهاية 3 &#39;. خلال التوليف العكسي، ورصدت في الشق الثاني من الحمض النووي 7-20 سنة مضت من موقع نيك الأصلي لإنشاء فواصل متداخلة التي تمتلئ لتشكيل توقيع تسلسل L1 الإدراج (على سبيل المثال، TTTTAA) دعا الازدواجية الموقع المستهدف (TSD) 9،10. وتعرف هذه العملية باسم هدفا رئيسيا عكس النسخ (TPRT) ويؤدي إلى insertiعلى النسخ الكاملة أو اقتطاع من L1 / السلطات الوطنية المعينة الأخرى مع TSDs على طرفي تسلسل المدرجة. كما ثبت L1 retrotransposition أن تتم من خلال TPRT مثل غير المتجانسة نهاية الانضمام في بعض الخلايا أنواع 11. متجه L1 retrotransposition العاملين في دراستنا هو غير episomal ويتكون من الموسومة L1 -ORF1 و2P يقودها المروجين-CMV L1-5&#39;UTR جنبا إلى جنب (الشكل 1) 12. وقد وصفت الإصدارات السابقة من هذا البناء في الدراسات التي تستخدم الخميرة والثقافات الخلية البشرية 13،14،15. اثنين من المروجين CMV متميز يقع في 5 &#39;و 3&#39; تنتهي من ناقلات، مع نهاية 3 &#39;وضعت في اتجاه عكسي لدفع التعبير من النيوميسين بعد الربط والتكامل. الكاسيت مؤشر retrotransposition في نهاية 3 &#39;يتكون من الجين إدراج العقاقير بالنيوميسين إلى L1 -ORFs وتقديم نشط من فصل إلى نصفين بواسطة غلوبفي إنترون مع الجهات المانحة تقسم (SD) ومواقع تقسم متقبل (SA) (الشكل 1). على الاندماج في كروموسوم، وكتب L1 من المروج مشترك لإنتاج الرنا المرسال الذي يتكون من مرنا bicistronic ومرنا بالنيوميسين غير نشط. أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين لاستعادة جين بالنيوميسين تعمل بكامل طاقتها. يتم حزم مرنا الهجين في الأداء الملاحي المطلوب في رابطة الدول المستقلة وtranslocated الى نواة حيث يتم دمجها في الجينوم إما كامل طول أو اقتطاع الإدراج باستخدام TPRT. نحن هنا وصف المنهجية التي تستخدم مضان في الموقع التهجين (FISH) مع تحقيقات موجهة تحديدا في الجين بالنيوميسين تقسم (SNeo) لتتبع أنماط -retrotransposiition L1 ومعدلات الإدراج في مستوى نواة واحدة. وأكد كفاءة وخصوصية كشف باستخدام retrotransposition المختصة وبنيات غير كفء وتحقيقات لديتإلخ SNeo أو النيومايسين وغلوبين إنترون تقاطع 16. حسابات هذه المنهجية لبعض من أوجه القصور في المقايسات retrotransposition ثقافة خلية مقرها، مثل الإدراج متعددة، ومقاومة مستعمرة والتوسع استنساخ مواتية.

<tbody><tr><table><td colspan = "4" ><قوي> مجسات الملصق< / قوي></td></tr> <tr><td>اذهب علامة DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x عازلة عديمة اللون</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>ضبط تركيز dATP ، dGTP ، dCTP إلى 2 & nbsp ؛ mM و dTTP إلى 1.5 &nbsp ؛ ملي مولار في الماء الخالي من النوكلياز.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotin (0.5 &nbsp; م)</td> <td>روش</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5 &nbsp ؛ م)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5 &nbsp ؛ م)</td> مجموعة أدوات وضع العلامات <td>على الأسماك من سيجما</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS</td><td></td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH</td> Kit <td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up Kit &nbsp ؛</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>يمكن استخدام أي كاشف نظيف PCR بدلا من NucleoSpin PCR Clean Up</td></tr><tr><td>Kit آلة</td><td></td><td></td> PCR يمكن <td>استخدام أي آلة Thermocycler لتضخيم منتج الملصق.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4" ><قوي> تحضير انتشارات الكروموسوم< / قوي></td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>إضافة Colcemid مباشرة إلى وسائط النمو إلى تركيز نهائي قدره 0.4&nbsp; ومايكرو. جم / مل</td></tr><tr><td>1 &nbsp ؛ M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>تمييع 1 &nbsp ؛ حل M KCl إلى 75 & nbsp; محلول ملي مولار لصنع محلول منخفض التوتر</td></tr><tr><td>محلول كارنوي المثبت</td><td></td><td></td><td>امزج 3 كميات من الميثانول و 1 حجم من حمض الأسيتيك لصنع محلول كارنوي المثبت. اجعلها طازجة في كل مرة.</td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>سيجما</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك</td><td>سيجما</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>يذوب Hoechst-33342 في PBS إلى التركيز النهائي ل 1 & nbsp ؛ ملغ/مل.</td></tr><tr><td>دايموند بوينت ماركر</td><td>ثيرمو سيانتيفيك</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>بلوستيد سلايدز</td><td>ثيرمو ساینتيف</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>تربسين-EDTA (0.25٪)</td><td>لايف تكنولوجيز&nbsp;</td><td>R001100</td><td>لإزالة تقنية الخلايا ، احتضان الخلية في التربسين لمدة 5 دقائق وغير نشطة بحجم متساو من الوسائط الكاملة.</td></tr><tr><td>شرائح الغطاء</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block يمكن</td><td></td><td></td><td>استخدام أي كتلة حرارية لهذا الغرض ، على الرغم من أنه يوصى باستخدام الكتل المجهزة لشرائح التدفئة.</td></tr><tr><td>دورق (600&nbsp; مل)</td> <td>سيجما</td><td>CLS1003600</td><td>املأ الدورق بالماء ، سخنه حتى يغلي ، استخدم البخار الساخن لتفجير الكروموسومات.</td></tr><tr><td>نيكون المجهر</td><td>نيكون</td><td>125690</td><td>يمكن استخدام أي مجهر للنظر في جودة الانتشار.</td></tr><tr><td colspan = "4" ><قوي>كواشف ومواد للأسماك < / قوية ></td></tr> <tr><td>ثلاثي الصوديوم سترات</td><td>سيجما</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>كرورايد الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>سيجما</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>توين -20</td><td>سيجما</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات ديتران</td><td>سيجما</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>سيجما</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>سمك السلمون المنوية الحمض</td><td>النووي تقنيات الحياة&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل البقر (BSA)</td> <td>سيجما</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك (N)</td> <td>سيجما</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>الكحول الإيثيلي</td><td>سيجما</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>سيجما</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>رناز A</td><td>سيجما</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>بيبسين</td><td>سيجما</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد (PFA)</td> <td>سيجما</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>إذابة Hoechst-33342 في PBS إلى التركيز النهائي ل 1 & nbsp ؛ ملغ/مل.</td></tr><tr><td>الأسمنت المطاطي / Cytobond مانع التسرب&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>سبع برطمانات كوبلين</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>غرفة رطبة داكنة</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>الشرائح الشرائح</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>كتلة حرارية رقمية جافة</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>مجهر</td><td></td><td></td><td></td>مضان</tr><tr><td>20x سترات الصوديوم المالحة (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>يمزج 175 جم من كلوريد الصوديوم ، و 88.2 &nbsp ؛ ز من سترات ثلاثي الصوديوم مع 800 مل من الدرجة الجزيئية H2O. يقلب أثناء الضبط على الرقم الهيدروجيني 7. بمجرد أن تذوب جميع الأملاح ، اضبط الحجم على 1 لتر وقم بالتصفية من خلال 0.22 & م ورق تصفية. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.</td></tr><tr><td>1&nbsp; ملغ / مل من Rnase A</td><td></td><td></td><td>يخفف 20x SSC buffer إلى 2x SSC buffer. قم بإذابة RNase A في 2x SSC buffer إلى تركيز نهائي 1 & nbsp ؛ ملغ/مل. اصنع حلا جديدا في كل مرة.</td></tr><tr><td>1٪ بيبسين</td><td></td><td></td><td>قم بإذابة البيبسين (W / V) في 10 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك إلى تركيز نهائي من محلول 1٪. اجعلها طازجة في كل مرة.</td></tr><tr><td>4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA)وزن</td><td></td><td></td> <td>4.0 غرام من PFA في غطاء الدخان ، أضف 50 مل من 1xPBS ، سخن إلى 60 & nbsp ؛ &deg; C أثناء التقليب وضبط الرقم الهيدروجيني بقطرات من هيدروكسيد الصوديوم حتى يذوب كل PFA ويصبح المحلول صافيا. اضبط مستوى الصوت على 100 &nbsp ؛ مل ، تصفية من خلال 0.22 وميكرو ؛ م ورق الترشيح وتخزين 5 مل من الكميات عند -20 &nbsp ؛ &deg;C. ذوبان الجليد من PFA عند 37&deg; C لمدة 10-15 دقيقة للاستخدامات اللاحقة. اضبط حجم الفلتر حسب كمية بارافورمالدهايد.</td></tr><tr><td>عازلة</td><td></td><td></td> الغسيل <td>امزج 100 مل من الفورماميد (20٪) مع 2.5 مل من 20x SSC ، واضبط على الرقم الهيدروجيني 7 مع 1.0 M HCl وارفع الحجم إلى 500 مل مع H2O.</td></tr><tr><td>عازلة</td><td></td><td></td> التهجين <td>اجمع بين 50٪ فورماميد ، و 10٪ كبريتات ديكستران ، و 0.1٪ SDS ، و 300 نانوغرام / مل من الحمض النووي للحيوانات المنوية من سمك السلمون في 2x SSC عازلة. تحدد كمية الفورماميد مدى تركيز الكروماتيدات. معايرة الكمية.</td></tr><tr><td>المخزن المؤقت</td><td></td><td></td> للكشف <td>يخفف 20x SSC المؤقت إلى 4x وإضافة 0.2٪ Tween-20 لإنشاء مخزن مؤقت للكشف.</td></tr><tr><td>المخزن المؤقت</td><td></td><td></td><td>المانع اجمع بين 5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) مع 0.2٪ Tween-20 في 4x SSC buffer.</td></tr><tr><td>محلول تجفيف يصنع</td><td></td><td></td><td>70٪ و 80٪ و 95٪ من محاليل الإيثانول.</td></tr></tbody></table>

تحليل الخط-1 retrotransposition في واحدة نواة مستوى

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

يمثل العنصر النووي العنصر النووي المتناثر الطويل -1 (السطر 1 أو L1) ما يقرب من 17٪ من الحمض النووي الموجود في الجينوم البشري. في حين أن غالبية L1s غير نشطة بسبب اقتطاعات 5 بوصات ، فإن ~ 80-100 من هذه العناصر تظل مختصة بالتحويل الرجعي وتنتشر إلى مواقع مختلفة في جميع أنحاء الجينوم عبر وسيطات الحمض النووي الريبي. بينما يعتقد أن L1s الأقدم تستهدف المناطق الغنية ب AT من الجينوم ، فإن أهداف الكروموسومات ل L1s الأحدث والأكثر نشاطا لا تزال غير محددة بشكل جيد. نصف هنا منهجية التهجين الموضعي (FISH) التي يمكن استخدامها لتتبع أنماط إدخال L1 ومعدلات دمج L1 خارج الرحم على مستوى النواة الواحدة. في هذه التجارب ، تم استخدام مجسات الفلوريسين إيزوثيوسيانات / السيانين -3 (FITC / CY3) المسماة بالنيومايسين لتتبع التحول الرجعي L1 في المختبر في خلايا HepG2 التي تعبر بثبات عن L1 خارج الرحم. تمنع هذه المنهجية الأخطاء في تقدير معدلات التبديل الرجعي الناجمة عن السمية وتأخذ في الحسبان حدوث عمليات إدخال متعددة في نواة واحدة.

ويرد رسم تخطيطي للناقلات retrotransposition L1 في الشكل 1. ويتكون ناقل الجين بالنيوميسين في اتجاه مضاد لL1 ORFS التي تقطعها إنترون الغلوبين في توجيه معنى وتقع بواسطة SD والمواقع SA. عند دمجها بشكل مستقر في كروموسوم، وكتب L1 مرنا من CMV جنبا إلى جنب والمروج L1-5&#39;UTR (الشكل 1). أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين. يتم حزم الجدد L1 RNA، translocated ...

نحن هنا توظيف منهجية FISH لتتبع الخط 1 retrotransposition على مستوى نواة واحدة في هوامش كروموسوم من خطوط الخلايا HepG2 التعبير عن ثابت خط 1 الاصطناعية.

تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحليل معدلات وأنماط الانتقال الراجع لـ L-1 على مستوى النواة الواحدة باستخدام التهجين الموضعي المتألق، أو FISH. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه المنهجية في أنها تسمح للباحث بتجنب المبالغة في تقدير أو التقليل من معدلات وأنماط الانتقال الراجع، وعند استكمالها بمنهجيات أخرى، تتيح دراسة الانتقال الراجع لـ L-1 على مستوى النوى الفردية. يقوم بتنفيذ هذا الإجراء اليوم الدكتور Pasano Bojang، وهو زميل أول في المختبر.للبدء، بعد تحضير هلام أغاروز بتركيز 0.7% إلى 1% في منظم TAE وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم CY3 أو FITC لوسم مسبار SNeo ثم قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. اخلط محلول مسبار SNeo الموّسم مع منظم تحميل DNA بتركيز 1X وقم بتحميله في آبار هلام الأغاروز. بعد ذلك، قم بتشغيل الهلام عند 75 إلى 100 فولت لمدة 15 إلى 20 دقيقة.باستخدام جهاز إضاءة بالأشعة فوق البنفسجية (UV illuminator)، قم بتحديد نطاق المسبار. وباستخدام شفرة نظيفة، استأصل مسبار SNeo المُسمى من الهلام. ثم استخدم طقم تنقية PCR وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة لإذابة وتنقية مسبار SNeo.بعد التنقية، قم بتشغيل خمسة ميكرولتر (5 µL) من المسبار المسمى بـ SNeo مع مسبار SNeo غير مسمى على هلام أغاروز بتركيز 0.7% لتأكيد زيادة الحجم وفقدان شدة الإشارة. ولتقدير كمية مسبار SNeo المسمى، قم بقياس الامتصاصية عند 260 نانومتر، ثم خفف مسبار SNeo إلى حصص بتركيز 10 نانوغرام لكل ميكرولتر (10 ng/µL) في ماء خالٍ من النوكلياز. تُحفظ هذه الحصص في درجة حرارة 20- درجة مئوية.بعد توليد مستنسخات مستقرة تعبر عن L-1 القادر على الانتقال الارتجاعي، أو الهيكل الناقل، يتم تنمية خلايا HepG2 التي تعبر بشكل مستقر عن الناقل الضابط، أو ناقل L-1. أضف 0.4 micrograms per milliliter من الكولسيميد (colcemid) إلى وسط المزرعة، ثم يتم التحضين لمدة 90 minutes لإيقاف الخلايا عند الطور الاستوائي.استخدم 10 milliliters من 1X Dulbecco's PBS، أو DPBS، لغسل الخلايا مرتين. ثم أضف محلول trypsin بتركيز 0.25% واتركه في الحاضنة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تمت إضافة وسط يحتوي على 10% FBS لإبطال مفعول trypsin.بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 milliliter وقم بطردها مركزياً عند 1,000 Gs ودرجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة دقيقتين. ثم اشفط الوسط من كتلة الخلايا واستخدم DPBS لغسل الخلايا. اشفط كل كمية DPBS باستثناء 200 microliters واستخدمها لإعادة تعليق الخلايا عن طريق النقر على الأنبوب أو السحب اللطيف بالمصّة لضمان خلط الخلايا جيداً وخلوها من التكتلات.أثناء تدوير الأنبوب أفقيًا، أضف خمسة مليلترات من المحلول ناقص التوتر المسخن مسبقًا على شكل قطرات، ثم حضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 120 Gs ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة كل المحلول ناقص التوتر باستثناء 200 ميكرولتر.اغسل بمحلول التثبيت ثلاث مرات، مع ترك ما يقرب من 200 µL من محلول التثبيت في الخلايا بين عمليات الغسل. بعد عمليات الغسل الثلاث، تأكد من أن الراسب أبيض ومنتفخ بشكل مرئي. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب باستخدام 200 µL من محلول تثبيت Carnoy، واستخدم محلول التثبيت لإجراء التخفيفات التالية للخلايا المعاد تعليقها.ضع 10 µL من كل تخفيف على شريحة جافة ونظيفة من ارتفاع سنتيمتر واحد تقريباً، وعرّض الجانب الخالي من العينة من الشريحة فوراً لبخار ساخن من ماء مغلي لمدة 30 ثانية. بعد تجفيف العينات في درجة حرارة الغرفة، صبغهُا باستخدام وسط تثبيت يحتوي على DAPI ثم ضع غطاء الشريحة. وبعد فترة التحضين، استخدم DPBS لغسل الشرائح ثلاث مرات.لعرض المستحضرات، استخدم مجهراً تباينياً يعتمد على الفلورة بقوة تكبير 40X. بعد تحسين تحضير المستحضرات، لا يكون من الضروري صبغها. ولتمييز المستحضرات الجيدة، استخدم قلم تحديد بـرأس ماسي على الجانب المقابل للشريحة.لتثبيت وتجفيف فروق الكروموسومات في الطور الاستوائي، أضف 200 µL من RNase A إلى العينات، واحضنها عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. اغسل الشرائح مرتين باستخدام 2X SSC لمدة خمس دقائق في كل مرة، واستخدم 10 mM HCl لشطف العينات. ثم أضف 1% pepsin إلى الفروق واحضنها عند 37 °C لمدة 10 دقائق.بعد استخدام الماء منزوع الأيونات لشطف الشرائح، استخدم 2X SSC لغسل العينات مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. ثم أضف 4%paraformaldehyde إلى العينات المفرودة واحضنها لمدة 10 دقائق، قبل إجراء غسلتين إضافيتين باستخدام محلول SSC المنظم بتركيز 2X. بعد غسلات SSC، قم بتجفيف العينات المفرودة عن طريق حضن العينات لمدة دقيقتين لكل تركيز في سلسلة الإيثانول التالية.أضف 30 nanograms من SNeo إلى محلول التهجين وسخنه عند 72 °C لمدة 10 دقائق، ثم اتركه ليبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد ذلك، انقل 30 µL من مسبار SNeo إلى كل شريحة مفرودة، واستخدم غطاء الشريحة لتغطية العينة. قم بإغلاق الحواف باستخدام الغراء المطاطي، مع التأكد من عدم تكون أي فقاعات.احتفظ بالشريحة على كتلة تسخين عند 72 °C لمدة خمس دقائق. ثم قم بخفض درجة الحرارة تدريجياً إلى 37 °C. احضن الشريحة طوال الليل في الظلام داخل غرفة رطبة عند 37 °C.لتطبيق الأجسام المضادة الثانوية، ابدأ بغمر الشرائح في محلول SSC المنظم بتركيز 2X لإزالة غطاء الشرائح. ثم اغمر الشرائح في محلول 2X SSC عند درجة حرارة 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لغسلها، قبل نقل العينات إلى محلول الغسل وغسلها مرتين عند درجة حرارة 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك، اغمر الشرائح في محلول SSC المنظم بتركيز 0.1X عند درجة حرارة 45 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.ثم اغسل الشرائح في محلول SSC بتركيز 2X عند درجة حرارة 45 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. وبعد تبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة، وفي حال استخدام مسابير مُعلمة مباشرة، استخدم محلول 2X SSC لغسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بموازنة الشرائح في محلول الكشف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف وسط تثبيت يحتوي على DAPI وقم بصبغ العينات صبغة تباينية لمدة 10 دقائق.ثبّت غطاء الشريحة واستخدم طلاء الأظافر لسد الحواف. وأخيراً، قم بتحليل الانتقال الارتجاعي L-1 باستخدام مجهر فلوري بقوة تكبير 40X. وكما هو موضح هنا، تم تحديد كثافة انتشار كروموسومات الطور الاستوائي عن طريق تحضير تخفيفات وتقييم كل انتشار من حيث الكثافة والتوزيع والمسافة بين الانتشارات والنواة.تم اختيار مفرودات ذات كثافة منخفضة وتوزيع متساوٍ للتحليل اللاحق. تمثل هذه الصور مفرودات صبغية صُبغت بصبغة Hoechst DAPI، وقد تم تقييم جودة المفرودات بناءً على طول الكروموسومات، واستدارة المفرودات، والمسافة الفاصلة بين الكروموسومات. وفي حال حضن الخلايا لفترة قصيرة في محلول ناقص التوتر، تصبح مفرودات الكروموسومات متشابكة بإحكام ويصعب تصور الكروموسومات الفردية.ومع ذلك، أدى التحضين لفترة أطول في المحلول ناقص التوتر إلى تمزق النوى، وتشتت الكروموسومات، و/أو فقدانها. كما أدى التحضين لفترات أطول في الكولسيميد (colcemid) إلى زيادة عدد الخلايا في الطور الاستوائي، ولكنه أدى إلى تكثف الكروموسومات. وكما هو موضح هنا، تبيّن أن التحضين لمدة 90 دقيقة في الكولسيميد، و20 دقيقة في المحلول ناقص التوتر عند 37 °C، واستخدام البخار الساخن لتفجير الخلايا، كانت الظروف المثالية لإنتاج مستحضرات انتشار عالية الجودة.في هذه التجربة، صُبغت الانتشارات الكروموسومية للكشف عن عملية الارتخال العكسي لـ L-1 باستخدام مجسات تستهدف SNeo. تم وسم المسبار بكل من FITC وCY3 لإظهار أن الارتخال العكسي لـ L-1 يظهر فقط في الخلايا التي تعبر عن L-1 من النوع البري في كلتا الحالتين. وبمجرد إتقان هذه التجربة، يمكن في الواقع إكمالها في غضون ست إلى ثماني ساعات، خاصة إذا تم تقليص أوقات التهجين إلى ساعتين إلى أربع ساعات ونُفذت التقنية بشكل صحيح.أثناء تنفيذ هذه التقنية، من المهم الغسل جيداً، وتحسين أوقات التهجين، ووسم مسابير dNTP كيميائياً لتجنب التلوث. وللإجابة على أسئلة إضافية مثل الموقع الكروموسومي للإدراج، يمكن استكمال تقنيات إضافية مثل تسلسل L-1 والتنطيط G-banding. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ستكتسب فهماً جيداً لكيفية وسم مسابير L-1، وإجراء الفروق الكروموسومية، وقياس أنماط ومعدلات الانتقال الوراثي العكسي لـ L-1 باستخدام تقنية التهجين الموضعي المتألق.لقد مهدت هذه التقنية الطريق لدراسة أنماط الانتقال التراجعي لـ L-1 بالإضافة إلى مواقع إدراج L-1. ومن المهم تذكر أنه عند التعامل مع العوامل السامة، والكواشف البيولوجية، وكذلك الأشعة فوق البنفسجية، فإن اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعدات الوقاية يُعد أمراً ضرورياً.

analysis-of-line-1-retrotransposition-at-the-single-nucleus-level

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

هنا، نقدم بروتوكول لمعدات وضع العلامات الفسيفساء الذي يسمح التصور من الخلايا العصبية المشتقة من خلية سلفية مشتركة في لونين مميزة. هذا يسهل تحليل النسب العصبية لديها القدرة على الخلايا العصبية الفردية التي يرجع تاريخها ولادة ودراسة وظيفة الجين في نفس الخلايا العصبية من مختلف الأفراد.

تحليل النسب الخلية ودراسات وظائف الجينات عن طريق التوأم بقعة MARCM

هنا، نحن تصف بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من مواقع التكامل من مولوني الفئران فيروس اللوكيميا النواقل الفيروسية القائمة على فيروس في الخلايا البشرية.

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

ويرد وصف بروتوكول قوية لمراقبة السكان العصبية بالفيديو-الفحص المجهري الوقت الفاصل بين تليها مرحلة ما بعد المعالجة المستندة إلى البرامج. ويمثل هذا الأسلوب أداة قوية لتحديد الأحداث البيولوجية في عدد سكان محدد أثناء تجارب التصوير الحي.

يعيش تصوير متبوعاً بخلية واحدة تتبع لرصد خلية علم الأحياء وتطور نسب السكان العصبية متعددة

نحن نقدم طريقة مؤتمتة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من germline ايليجانس كاينورهابديتيس . أسلوبنا يحدد عدد والموقف من كل نواة داخل الخط وتحليلات germline البروتين التوزيع وهيكل cytoskeletal.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

هنا ، نقدم نهج المعلوماتية الحيوية وتحليلات لتحديد خط-1 التعبير علي مستوي معين.

الجيش النيبالي الجديد الجيل التالي التسلسل وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحديد خط التعبير-1s في مستوي محدد الموضع

توضح هذه المقالة اختبارًا بسيطًا يستند إلى PCR لمراقبة نشاط الرجعية LINE-1 النشطة ولرسم خريطة للتبديل الرجعي في جينوم معين. باستخدام خط الخلية MCF7، نبين هنا كيف يمكن تطبيق هذا الأسلوب للكشف عن نشاط LINE-1 الموجود في 22q12.1.

الكشف عن نشاط الرجعية من الخط الساخن-1S من قبل لمسافات طويلة معكوس PCR

هنا ، يعرض المؤلفون فائدة MULTI-seq للتنميط الظاهري وما تلاه من scRNA-seq و scATAC-seq في توصيف ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين في شبكية العين.

تحليل متعدد الإرسال للتعبير الجيني للشبكية وإمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام scRNA-Seq و scATAC-Seq

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.

عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

اكتشف تحليل LINE-1 Retrotransposition على مستوى النواة الواحدة باستخدام تقنية FISH في خلايا HepG2. تتيح هذه الطريقة تقييم دقيق لمعدلات وأنماط الانتقال العكسي الجينومي.

تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

استكشف المزيد من الفيديوهات