Transcriptome على من التنميط في الجسم الحي إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Microarray بالقياس الكمي والتنميط الجيني للنصوص على مستوى الجينوم. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول إجراء تقنيا محسنا في مصفوفة أبقار مخصصة بلونين باستخدام أجنة البقر في اليوم السابع لإثبات جدوى استخدام كمية منخفضة من إجمالي الحمض النووي الريبي.

الهدف العام من هذا الفيديو هو توفير إجراء تقني محسن باستخدام مصفوفة أبقار مصنوعة حسب الطلب بلونين باستخدام كمية منخفضة من إجمالي الحمض النووي الريبي من أجنة الأبقار في اليوم السابع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالفقدان الجنيني في أبقار الألبان عالية الإنتاج والأسئلة حول الجودة الجنينية بالنسبة للتعبير الجيني في الجنين النامي قبل الزرع. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنه يمكننا دراسة التعبير الجيني باستخدام مستوى بيكوغرام لإجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من أجنة مفردة.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للعامل الذي يؤثر على بقاء أجنة الأبقار المنتجة قبل الزرع في الجسم الحي. يمكن أن يساعد هذا أيضا في تحسين تقنيات الإنجاب مثل إنتاج الأجنة في المختبر. لبدء الإجراء ، قم بإعداد أجنة الأبقار المجمدة في أنبوب طرد مركزي دقيق من مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي على مقياس بيكو قائم على العمود.

أضف 10 ميكرولترات من محلول التحلل إلى الأنبوب ، واحتضن الأجنة عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقتين عند 800 مرة G.Pipette 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتكييف في غشاء مرشح عمود التنقية ، واحتضان العمود لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز الطرد المركزي لأنبوب التجميع عند 16 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة لإنهاء التكييف المسبق للعمود.

أضف 10 ميكرولترات من 70٪ من الإيثانول إلى خليط محلول التحلل والأجنة واخلطها جيدا. ثم قم بتحميل الخليط على عمود التنقية. الطرد المركزي للعمود لمدة دقيقتين عند 100 مرة G ، ثم عند 16 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية.

أضف 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل الأول إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 8 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. باستخدام مجموعة DNase ، امزج خمسة ميكرولترات من محلول المرق مع 35 ميكرولترا من المخزن المؤقت ، واخلطها عن طريق قلب الأنبوب المغلق برفق. بعد ذلك ، قم بتحميل خليط DNase على غشاء عمود التنقية ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

أضف 40 ميكرولترا من مخزن الغسيل الأول إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 8 ، 000 مرة G لمدة 15 ثانية. ثم أضف 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني ، وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة. أضف جزءا آخر من مخزن الغسيل الثاني إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 16 ، 000 مرة G.انقل عمود التنقية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق آخر ، وقم بتحميل 11 ميكرولترا من مخزن الشطف المؤقت على غشاء العمود.

احتضان العمود لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بالطرد المركزي للعمود لمدة دقيقة واحدة عند 1 ، 000 مرة G ، ثم لمدة دقيقة أخرى عند 16 ، 000 مرة G. تحقق من جودة وكمية الحمض النووي الريبي الملطوع ، ثم قم بتخزين العينة في سالب 80 درجة مئوية. باستخدام مجموعة تضخيم ، قم بتضخيم 100 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي عالي الجودة.

قم بتقييم نطاق حجم الحمض النووي الريبي المضخم مع الكمية القائمة على الفلورة. ثم حدد تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق القياس الطيفي. قم بإعداد ميكروغرامين من الحمض النووي الريبي المضخم لوضع العلامات الفلورية باستخدام مجموعة قياسية.

قم بإعداد صندوق الأوزون في غرفة مظلمة ، وانتظر حتى ينخفض مستوى الأوزون إلى 0.001 جزء في المليون. ضع مرشح غرفة مظلمة فوق الضوء. بعد ذلك ، أحضر العينة إلى صندوق الأوزون وأضف ميكرولترين لكل من صبغة السيانين الخمسة ومخزن مؤقت للوسم.

مع العينة تحت ضوء آمن ، أضف الماء الخالي من RNase لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولترا. امزج العينة برفق ، ثم احتضن الأنبوب في جهاز تدوير حراري عند 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتبريد العينة على الثلج لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بتدوير العينة.

قم بتنظيف الحمض النووي الريبي الملصق والمضخم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. باستخدام النوع المناسب من مطياف ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي المسبب للتمييز والمضخم. قم بإعداد عينة ثانية من الحمض النووي الريبي المضخم المسمى بصبغة السيانين الثلاثة.

قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. اجمع بين 825 نانوغراما لكل من Cy3 و 5-aRNA المسمى بعلامة 5. أضف إلى ذلك المخزن المؤقت للحظر والمخزن المؤقت للتجزئة.

احتضن الخليط على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم يبرد على الثلج لمدة دقيقة واحدة. أضف 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين ، واخلط جيدا دون إدخال فقاعات الهواء. الطرد المركزي الخليط عند 11 ، 300 مرة جم لمدة دقيقة واحدة.

قم بتحميل 100 ميكرولتر من العينة على شريحة المصفوفة ، وأغلق الشريحة في غرفة التهجين. قم بتهجين العينة لمدة 17 ساعة عند 65 درجة مئوية أثناء الدوران بمعدل 10 دورات في الدقيقة. قم بإعداد محلول تثبيت وتجفيف لكسح الأوزون.

اغسل المصفوفات ، واتخذ الاحتياطات اللازمة لتقليل التعرض للأوزون ، ثم اغمرها في محلول التثبيت والتجفيف لمدة 30 ثانية. تأكد من أن سطح المصفوفة جاف وخالي من الغبار. قم بتخزين المصفوفات في مكان مظلم.

قم بتشغيل الماسح الضوئي للمصفوفة الدقيقة ، وانتظر حتى يصبح جاهزا للمسح. ثم قم بتحميل المصفوفة بالرمز الشريطي إلى اليسار. قم بإجراء تحليل موضعي ، واحفظ البيانات كملف GPR.

في برنامج التحليل الإحصائي ، قم بتطبيع البيانات وتحليلها. احسب عتبة تحديد البقعة الإيجابية ، واعرض مخطط الإشارات المهجنة والخلفية. قم بإجراء تطبيع اللوس داخل المصفوفة ، ثم الكمية بين تطبيع المصفوفات.

تصدير البيانات التي تمت تسويتها إلى ملف جدول بيانات. استخدم جميع الإشارات الإيجابية في مستودع بيانات المصفوفات الدقيقة لإنشاء قائمة معرف للجينات الفريدة المحددة. قم بتحميل قائمة المعرفات إلى قاعدة بيانات تصنيف وتحليل البروتين ، واختر bos taurus ككائن حي ، وقم بإجراء اختبار تمثيل إحصائي افتراضي للإفراط في التمثيل.

بعد التضخيم الدائري، تكون الشظايا متشابهة جدا في الحجم وذات نوعية جيدة. يجب أن يؤدي التضخيم الناجح بهذه الطريقة إلى زيادة ما لا يقل عن ألف ضعف في الحمض النووي الريبي. تتميز صورة المصفوفة الدقيقة عالية الجودة بكثافة موضعية عالية وكثافة خلفية منخفضة على كلتا القناتين.

إذا كانت شدة الخلفية عالية جدا ، فستكون دقة الإشارة ضعيفة. كان حوالي 46٪ من البقع فوق الخلفية ، والتي تم عزل 6،765 نسخة فريدة من الحمض النووي الريبي المعبر عنها في الكيسة الأريمية. أشار اختبار التمثيل الإحصائي المفرط إلى أن أفضل 10 مصطلحات أنطولوجيا جينية تمثل عمليات الانقسام الخلوي النشطة.

سمح تطوير هذه التقنية للباحثين في مجال التكاثر الحيواني باستكشاف التعبير الجيني الجنيني وتقييم كيفية تأثير العوامل المختلفة على الجنين النامي. تم تطوير هذه التقنية أيضا في أنواع مهمة أخرى ، مثل الخنزير. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للتحقق من صحة نتائج المصفوفات الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج الحمض النووي الريبي من الأجنة وكذلك كيفية تضخيم وتسمية الحمض النووي الريبي لإجراء تحليل المصفوفات الدقيقة ثنائي اللون.