التحضير للثقافات الجرذ دبقية قليلة التغصن السلف والكمي لOligodendrogenesis عن طريق ثنائي الأشعة تحت الحمراء الضوئي الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل واستزراع الخلايا السلفية للفئران قليلة التغصن وتحديد تكوين الدبقية قليلة التغصن استجابة للعوامل التجريبية. تكوين الدبقية قليلة التغصن الفعال هو الهدف العلاجي في العديد من مجالات البحث ، بما في ذلك إصابة الحبل الشوكي ، ونقص الأكسجة عند حديثي الولادة ، والأمراض المزيلة للميالين مثل التهاب النخاع المستعرض والتصلب المتعدد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين بروتوكول لعزل أعداد كبيرة من OPCs مع طريقة سريعة وموثوقة لتحديد تكوين الدبقية قليلة التغصن عبر ظروف تجريبية متعددة في وقت واحد.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتعقيم جميع معدات التشريح باستخدام معقم حبة ساخن. ثم أضف 15 إلى 20 مل من PBS إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. ضع الأنبوب المخروطي على الجليد ، واستخدمه لتثبيت أنسجة القشرة المقطعة أثناء التشريح.

بعد ذلك ، أضف PBS البارد إلى طبق بتري بطول 10 سم والذي سيتم استخدامه للتشريح تحت المجهر الضوئي. بعد التضحية بجراء الفئران ، قم بقص الجلد خلف الأذنين على طول خط الوسط باستخدام مقص صغير. وقشر اللوحات الجلدية مرة أخرى.

بعد ذلك ، قم بقص الجمجمة على طول خط الوسط من جذع الدماغ إلى العينين. واحرص على عدم القطع العميق جدا من أجل الحفاظ على بنية القشرة الأساسية. بعد ذلك ، قم بعمل قطعتين جانبيتين أدنى من المخيخ عن طريق إدخال مقص جراحي صغير في الثقبة العظمى.

قم بعمل قطع إضافي بين العينين الأمامية للبصيلات الشمية. قشر كل نصف من الجمجمة بعناية. قم بإزالة الدماغ بالكامل وضعه في طبق بتري بطول 10 سم مليء ب PBS البارد.

تحت المجهر الضوئي التشريح ، قم بإزالة المصابيح الشمية والمخيخ باستخدام ملقط جراحي دقيق. اقلب الدماغ بحيث يكون السطح البطني مرئيا. بعد ذلك ، باستخدام ملقط مستقيم ناعم ، قم بإجراء تشريح حاد عن طريق وضع أطراف ملقط مغلقة بين القشرة وما تحت المهاد على عمق حوالي ثلثي الدماغ.

افتح الملقط بمجرد وضعه في مكانه ، ثم كرر الإجراء لنصف الكرة الأرضية الآخر. بعد ذلك ، قم بإثارة القشرة من منطقة ما تحت المهاد والدماغ المتوسط. قم بإزالة منطقة ما تحت المهاد والمهاد والدماغ المتوسط عن طريق تثبيت الدماغ المتوسط على سطحه الخلفي وتقشيره باتجاه الطرف الأمامي من الدماغ.

بعد ذلك ، قطع الروابط الأمامية. باستخدام ملقط تشريح منحني ناعم ، قم بإزالة الحصين وقطع اتصاله بالقشرة. بعد ذلك ، قم بإزالة المخطط المتبقي عن طريق كشطه من القشرة الأساسية بحركة قطرية خارجية.

قم بتنظيف الأوعية الدموية والسحايا من السطح البطني للقشرة. بعد ذلك ، اقلب الدماغ بحيث يكون السطح الظهري مرئيا. قشر السحايا من القشرة الأساسية حيث توجد البصلة الشمية.

كرر الإجراءات لما مجموعه ثلاثة إلى أربعة صغار فئران. ووضع جميع القشرة المقطعة في طبق بتري. قم بتقطيعها بشفرة حلاقة معقمة حتى يتم تحقيق قطع ملليمتر واحد في ملليمتر واحد.

ثم اجمع المناديل عن طريق شطف الطبق باستخدام PBS قبل وضعه مرة أخرى على الثلج. الآن ، باستخدام ماصة باستور زجاجية متصلة بوحدة تحكم في الماصة ، قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق سحب الأنسجة من عشر إلى خمس عشرة مرة أو حتى يتم تقليل حجم قطع الأنسجة ويصبح المحلول غائما. بعد ذلك ، أعد العينة إلى حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الدوران المستمر.

بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من PBS إلى كل عينة وقم بتصفية الجانس من خلال مرشح مسام 40 ميكرومتر يوضع فوق أنبوب 50 ملليلتر. ثم اشطف الفلتر بمقدار إضافي من واحد إلى ملليلترين من PBS. قم بتجميع جميع العينات المتجانسة في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مليلتر واحصل على عدد إجمالي للخلايا.

بعد إجراء عد الخلايا ، قم بتقسيم التجانس بالتساوي إلى أنابيب مخروطية 15 مليليتر ، وقم بطردها لمدة 10 إلى 12 دقيقة عند 300 جرام. قم بتجهيز كل عمود LS بإضافة خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للعمود. وجمع التدفق من خلال أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

بمجرد مرور المخزن المؤقت للعمود بالكامل عبر الغرفة العلوية ، قم بتطبيق 1000 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل عمود واسمح للخلايا بالمرور عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، قم بإزالة كل عمود وضعه في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للعمود واغمر المخزن المؤقت عبر العمود بمعدل سريع لإخراج الخلايا المرتبطة وتحريرها من العمود.

للوحة الخلايا ، قم بتخفيفها بوسائط انتشار OPC إلى 60 ، 000 خلية لكل مليلتر. ماصة 500 ميكرولتر من الخلايا على طول جانب كل بئر قاع أسود واضح من صفيحة 24 بئر. امزج الخلايا عن طريق هز اللوحة أفقيا باستخدام حركة الشكل الثامن.

في هذا الإجراء، ضع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر فوق ماصة باستور زجاجية لضمان عدم تلف البئر أثناء الشفط. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط من آبار الثقافة مجموعة معالجة واحدة في كل مرة لتجنب تجفيف الخلايا. بعد ذلك ، أضف ببطء 500 ميكرولتر من مزيج المعالجة الرئيسي على طول جانب البئر باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد.

احتضان الثقافات وإجراء تبادل إعلامي كامل مع وسائط معالجة جديدة كل يومين إلى ثلاثة أيام. في نهاية فترة العلاج المطلوبة ، استنشق الوسائط. أضف ببطء 400 ميكرولتر من PFA إلى جانب البئر لإصلاح الخلايا.

واحتضان الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة ، قم بشفط PFA وأضف ببطء 500 ميكرولتر من D-PBS المعقم لغسل الخلايا. كرر الغسيل مرتين أخريين ولا تستنشق الغسيل النهائي.

الآن ، قم بإحضار اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة ، واستنشق الآبار ، وأضف 250 ميكرولترا من D-PBS تحتوي على خمسة بالمائة من NGS و 0.1 في المائة Triton x-100. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري لطيف. قم بإعداد محلول الحضانة الأولي عن طريق تخفيف الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل MBP والجسم المضاد للأرانب متعدد النسيلة المضاد ل olig2 في D-PBS الذي يحتوي على خمسة بالمائة من NGS.

بعد ذلك ، احتضن الأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية طوال الليل لمدة 16 إلى 18 ساعة مع اهتزاز مداري لطيف. أثناء غسل اللوحة ، قم بإعداد محلول الحضانة الثانوي عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للفأر 680 ، والأجسام المضادة للأرانب 800 في D-PBS التي تحتوي على خمسة بالمائة من NGS. بعد ذلك ، قم بشفط الغسيل النهائي وأضف 250 ميكرولتر من محلول الحضانة الثانوي.

احم اللوحة من الضوء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري لطيف. بعد ذلك ، قم بمسح اللوحة باستخدام نظام تصوير قادر على الكشف عن انبعاثات مضان 700 نانومتر و 800 نانومتر. كنقطة بداية، اضبط الإزاحة البؤرية على ثلاثة، والحساسيات إلى نقطة واحدة وخمسة ل MBP، وخمس نقاط صفر للأكتين، وثلاث نقاط خمسة ل olig2.

اضبط قيم الحساسية حسب الحاجة لتجنب التعرض المفرط للإشارة. في هذا التخطيطي ، يبدأ اختبار DIFS ب Opcs الإيجابية للفئران A2B5 المعزولة حديثا المطلية على أوعية الاستزراع المشفرة PLL. تتكاثر هذه الثقافات لمدة ثلاثة أيام في وجود 20 نانوغرام لكل مليلتر PDGFAA ، ثم يتم معالجتها بعوامل تجريبية في وسائط جديدة خالية من PDGF في اليوم صفر.

يتم تجديد وسائط العلاج بالكامل في اليوم الثاني. ويتم تثبيت الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد في اليوم الرابع. هنا ، تم إجراء الكيمياء الخلوية المناعية ل olig2 و MBP على الثقافات التمثيلية في اليوم صفر واليوم الرابع باستخدام Dapi كصبغة مضادة للنواة.

تظهر هذه الثقافات تلطيخا تأسيسيا لعلامة خلية سلالة الخلايا قليلة التغصن ، Olig2 ، في اليومين صفر ورابع. في حين أن تلطيخ علامة الخلايا قليلة التغصن الناضجة MBP لم يكن واضحا إلا في اليوم الرابع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية وثقافة وتمييز OPCs الإيجابية للفئران A2B5 من أجل تحديد تأثير العوامل التجريبية على تكوين الدبقية قليلة التغصن.

إن تحديد العوامل التي تعزز تكوين قليلة التغصن له أهمية خاصة لدراسة الأمراض المزيلة للميالين مثل التصلب المتعدد. بمجرد إتقانها ، قد تساعد التقنيات الموضحة هنا في تحديد مثل هذه العوامل وتطوير علاجات أفضل في النهاية.