تصميم والتعبئة والتغليف، وتسليم العليا العيار الحجمي كريسبر الرجعية وLentiviruses عبر التجسيمي الحقن

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين الباحثين من تصميم وتعبئة الفيروسات التي تعبر عن بروتين الفلورسنت ، CAS9 و sgRNAs ، ثم حقنها بشكل تجسيمي في دماغ الفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة محددة في مجال علم الأعصاب مثل دور الجينات التي تكمن وراء الاضطرابات العصبية والنمائية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على التلاعب بجينات معينة دون الحاجة إلى عملية كثيفة الوقت والموارد لإنشاء معدلة وراثيا.

قبل تحضير الخلايا ، استخدم موقعا إلكترونيا لإنشاء خيط توجيه 20 نيوكليوتيدات أو sgRNA والذي سيتم استخدامه لتصميم oligos مفردة تقطعت بهم السبل. بعد طلب oligos واستخدامها لإنشاء بلازميد نهائي كما هو موضح في بروتوكول النص ، استمر في سحب جميع الخلايا th-od من أنبوب التبريد إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد ذلك ، أضف 2 مل من ثاني أكسيد الكربون المسخن مسبقا IMDM الكامل.

ثم الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 500 مرة G.بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من IMDM الكامل. ضع الخلايا على طبق ثقافة خلية مقاس 10 سم واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد 24 ساعة من الطلاء ، قم بتغيير الوسائط عن طريق شفط الوسائط الموجودة وإضافة 10 مل من IMDM الدافئ مسبقا.

قم بتقسيم الخلايا بمجرد التقاءها. لتقسيم الخلايا ، استنشق الوسائط واغسل الطبق ب 5 ملليلتر من PBS. ثم أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين إلى الطبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية حتى ترفع الخلايا عن اللوحة.

بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من IMDM لتحييد تفاعل التربسين وماصة الخلايا في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من IMDM وقم بتخفيف 10 ميكرولتر من الخلايا في 90 ميكرولتر من PBS.

عد الخلايا إما باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي وأعد طلاء الخلايا باستخدام IMDM كامل. في اليوم الخامس ، قم بتغيير الوسائط قبل ساعتين من التعدي وتأكد من وجود 10 ملليلتر بالضبط من الوسائط في لوحة 10 سم. بعد ذلك ، قم بإعداد كواشف الإرسال لاثنين من التقطيع باستخدام أنبوبين من البوليسترين القاع المستدير سعة خمسة ملليلتر.

قم بتسمية الأنبوب الأول على أنه DNA والأنبوب الثاني على أنه 2X HBS. ثم اضبط تركيز الحمض النووي على ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر في Tris EDTA عند PH 7.4. لعمل كواشف تعداء لفيروسات العدس والفيروسات القهقرية ، أضف المكونات المطلوبة ببطء إلى الأنبوب المسمى الحمض النووي مع النقر باستمرار على الأنبوب للخلط.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من 2X HBS إلى الأنبوب المسمى 2X HBS. بعد ذلك ، أضف ببطء ملليلترا واحدا من المحتويات من أنبوب الحمض النووي إلى أنبوب HBS 2X ، قطرة واحدة في كل مرة. اضغط باستمرار على أنبوب 2X HBS ولاحظ راسب فوسفات الكالسيوم المتشكل بعد كل قطرة لضمان الإنشاء الناجح لمجمعات التعدين.

بعد ذلك ، احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، أضف ملليلترا واحدا من كاشف التعداء في قطرات بطيئة إلى كل صفيحة خلية يبلغ طولها 10 سنتيمترات واحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. استبدل الوسائط في اليوم السادس.

في اليوم السابع ، انقل الوسائط التي تحتوي على جزيئات فيروسية بماصة مصلية سعة 10 مليلتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر قبل تخزينها عند أربع درجات مئوية. ثم أضف ثمانية ملليلتر من وسائط FBS 0.5٪ إلى كل لوحة خلية. في اليوم الثامن ، اجمع الوسائط الخلوية التي تحتوي على جزيئات فيروسية ودمجها مع حصاد اليوم السابق في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

في هذه الخطوة ، قم بالطرد المركزي للطافي الفيروسي عند 2000 مرة جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتنقية الوسائط الفيروسية عن طريق تصفيتها من خلال مرشح حقنة ربط منخفض البروتين 0.45 ميكرومتر. بعد ذلك ، أضف محلول 5X البولي إيثيلين جلايكول 6000 إلى الوسائط.

اقلب الأنبوب عدة مرات للخلط. ثم احتضان الخليط الفيروسي عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل. في اليوم التاسع ، قم بالطرد المركزي للخليط الفيروسي عند 2500 مرة جم لمدة 45 دقيقة.

بعد 45 دقيقة ، تخلص من المادة الطافية وقم بتدويرها مرة أخرى لمدة دقيقتين. تليها إزالة المادة الطافية مرة أخرى. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات بإضافة 320 ميكرولتر من PBS المعقم واحتضانها على الخلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

في اليوم التالي ، قم بنقل الفيروس وتجميد الحصص عند سالب 80 درجة مئوية. لبدء هذا الإجراء ، احلق رأس الفأر المخدر من أجل الاستعداد لموقع الحقن. مباشرة 4٪ isoflurane في مخروط الأنف.

بعد ذلك ، ضع الماوس في الأداة التجسيمية. أدخل قضيب العضة في فمه حتى تسقط أسنانه في الفتحة قبل تثبيت قضبان الأذن. تأكد من أن جسم على وسادة التدفئة وأن الأنف يقع في مخروط الأنف.

بعد ذلك ، قم بتأكيد التخدير عن طريق إعطاء قرصة في القدم. ثم ضع الدموع الاصطناعية لتليين العينين. بعد ذلك ، قم بمسح الرأس المحلوق بالبوفيدون واليود والليدوكائين.

الآن قم بعمل شق صغير على طول خط منتصف فروة الرأس. جفف الجمجمة بمسحة واستخدم بيروكسيد الهيدروجين للمساعدة في تصور البرجما. باستخدام نطاق تشريح ، حدد موقع بريجما على الجمجمة وضع الحفر فوقها.

اضبط الإحداثيات التجسيمية الرقمية للمستويات X و Y و Z على الصفر. من أجل التأكد من تسوية الرأس على المحور الذيلي المنقاري Y ، ضع الحفر على لامدا وقم بتسوية الرأس بحيث يكون إحداثي Z مساويا تقريبا للصفر عند بريجما ولامدا. للتأكد من تسوية الرأس على طول المحور X ، ضع الحفر على نقطة المنتصف بين بريجما ولامدا وقم بقياس إحداثيات Z عند ملليمتر واحد من نقطة المنتصف على كلا الجانبين للتأكد من تساويها.

بعد ذلك ، قم بخفض الأيزوفلوران إلى 2٪ قبل وضع المثقاب فوق الإحداثيات المطلوبة وحفر الجمجمة بعناية. بعد حفر جميع الثقوب ، قم بلصق المحقنة المملوءة بالفيروسات على الأداة التجسيمية. قم بتوسيط المحقنة فوق الفتحة واضبط إحداثيات Z عند الجمجمة على الصفر.

اخفض المحقنة ببطء إلى أعمق عمق Z وابدأ الحقن بمعدل 0.25 ميكرولتر في الدقيقة باستخدام حاقن تجسيم. بعد اكتمال الحقن في أعمق عمق Z ، انتظر دقيقة واحدة قبل رفعه إلى الإحداثيات التالية وابدأ الحقن مرة أخرى. استمر في هذا النمط حتى يتم حقن جميع إحداثيات حقن Z.

بعد الحقنة الأخيرة ، انتظر دقيقتين قبل إزالة المحقنة. ثم قم بإزالة الماوس من الأداة التجسيمية وخياطة فروة الرأس. ضع الليدوكائين والكريم المضاد للبكتيريا على موقع الجراحة وقم بإعطاء مسكنات الألم قبل نقل إلى غرفة الانتعاش الساخنة.

أظهرت هذه الصورة الفلورية ذات المجال العريض 10X أن الفيروسات القهقرية عالية العيار تصيب عددا كبيرا من الخلايا التي يمكن تقييم مورفولوجيتها عن طريق التعبير الفلوروفوري. في هذا المثال ، تمت صياغة الفيروسات التي تعبر عن GFP أو mCherry في التلفيف المسنن. باستخدام نظام من الفيروسات القهقرية ، يمكن للمرء استخدام فيروس واحد لإجراء معالجة جينية واحدة تتميز ب GFP ومعالجة أخرى تتميز ب mCHerry ثم تقييم التغييرات الفردية أو المضافة بسبب كل فيروس.

هذه إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمدى الحقن الذي تم فيه تتبع الخطوط المغلقة لانتشار الفيروس على مدار 21 قسما تسلسليا. ثم تمت محاذاة تتبع الكفاف لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد لقياس حجم الحجم. يظهر الانتشار الكلي للفيروسات باللون الأخضر ويظهر الانتشار الموضعي التوتري باللون الأرجواني.

تظهر هذه الصورة الفيروس ينتشر على طول مسار الإبرة والجسم الثفني بالإضافة إلى ملء المحور الذيلي المنقاري للتلفيف المسنن. بعد الحقن الفيروسي في الجسم الحي ، نستخدم طرقا أخرى مثل علم الأنسجة أو الفيزيولوجيا الكهربية أو العيش مرتين على الفحص المجهري لدراسة نتيجة التلاعب الجيني على تطور الخلايا العصبية.