تحليل في فيفو الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل وظيفة الجين المرشح في التحكم في هجرة الخلايا في الجسم الحي باستخدام زرع الخلايا جنبا إلى جنب مع التصوير الحي في جنين الزرد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال هجرة الخلايا مثل تحديد دور وأهمية الجينات المرشحة الجديدة في هجرة الخلايا في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تخلق أجنة فسيفساء تسمح بالتصوير الجيد والعضال الغدي الخلوي.

لتحضير إبر زرع الخلايا ، استخدم مجتذب ماصة صغير لسحب كابيلياري زجاجي. ثم ، باستخدام microforge ، قم بقطع طرف الإبرة عند النقطة التي يبلغ فيها القطر الداخلي 35 ميكرومتر. باستخدام مطحنة دقيقة شطبة الطرف المقطوع من الشعيرات الدموية بزاوية 45 درجة.

للتخلص من بقايا الزجاج ، أدخل الإبرة في حامل إبرة مثبت على حقنة ، ثم استخدم حمض الهيدروفلوريك بنسبة 2٪ لشطف الجزء الداخلي من الإبرة ثلاث مرات عن طريق سحب المحلول للداخل والخارج. اتبع شطف الإبرة بالأسيتون ثلاث مرات. لتحضير الأطباق للحقن أو زرع الخلايا ، قم بإعداد 1٪ agarose عن طريق تسخين 50 مل من وسط الجنين الذي يحتوي على 0.5 جرام من الاغاروز في الميكروويف لمدة دقيقة واحدة بكامل طاقته.

قم بتبريد جل الاغاروز إلى حوالي 60 درجة مئوية واسكب الحجم بالكامل في طبق بتري 90 ملم. أدخل قالبا لإنشاء خطوط للحقن أو لإنشاء آبار لزرع الخلايا. عندما يتم ضبط جل الاغاروز ، استخدم الملقط لإزالة القالب.

لحقن أجنة المتبرعين ، تحت المجهر المجسم ، استخدم الملقط للضغط برفق على الأجنة المعدلة وراثيا التي تم جمعها في خطوط طبق الحقن المملوء بوسط الجنين. باستخدام الملقط ، قم بتوجيه الأجنة مع الخلايا نحو الأعلى ثم احتضان الطبق عند 28 درجة مئوية حتى تصل الأجنة إلى مرحلة الخلايا الأربع. بعد ذلك ، قم بتحميل إبرة حقن بميكرولترين من محلول الحقن المعد مسبقا والذي يحتوي على مجال ربط الأكتين لبروتين ربط الأكتين بالخميرة 140 المرتبط ب mcherry.

ثم أدخل الإبرة في حامل إبرة متصل بمعالج دقيق ومتصل بجهاز إرسال هواء. افتح الإبرة باستخدام ملقط دقيق للمس طرف الإبرة برفق أو عن طريق الضغط على أطرافها. ثم أدخل الإبرة في إحدى الخلايا الأربع وحقن المحلول لملء 70٪ من حجم الخلية.

حقن 30 جنينا بطريقة مماثلة. عندما تصل الأجنة إلى مرحلة الكرة ، استخدم ماصة المراعي البلاستيكية لنقل أجنة GFP المعدلة وراثيا المضيفة والأجنة المانحة المحقونة مسبقا في أطباق بتري منفصلة مقاس 35 ملم مغطاة بملليمتر واحد من الاغاروز في وسط الجنين ومليئة بوسط جنين القلم / البكتيريا. باستخدام ملاقط دقيقة ، قم باستخراج الأجنة يدويا من مشيمتها.

ثم ضع الأجنة في الحاضنة عند 28 درجة مئوية. عندما تصل الأجنة إلى مرحلة الدرع تحت المجهر الفلوري ، اختر أجنة متبرعة تعبر عن ABP140 mcherry داخل الدرع الأخضر. باستخدام ماصة المراعي المصقولة بالنار ، انقل الأجنة المضيفة إلى صف من الآبار في طبق زرع الخلية المملوء بالقلم / البكتيريا العقدية EM. ثم ضع الأجنة المانحة في الصف المجاور.

بعد ذلك ، باستخدام رمش ، قم بتوجيه الأجنة بعناية مع الدرع لأعلى. ثم باستخدام حامل إبرة متصل بحقنة ، اشطف طرف الإبرة عن طريق سحب وطرد 70٪ من الإيثانول. جفف الإبرة عن طريق سحب الهواء إليها.

عندما تجف الإبرة ، أدخلها في حامل الإبرة المتصل بحقنة هاميلتون مع توجيه الشطبة لأعلى. لإجراء عملية زرع درع للدرع ، أدخل درع جنين متبرع بإبرة الزرع وارسم حوالي 10 إلى 20 خلية تحمل علامة ABP140 mcherry. تجنب بعناية رسم صفار البيض.

زرع الخلايا في درع الجنين المضيف وكرر نقل الخلايا حتى يتم زرع جميع الأجنة المضيفة. عند اكتمال عملية الزرع ، استخدم ماصة المراعي المصقولة بالنار لإزالة أي أجنة تالفة. احتضان الأجنة المزروعة عند 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا للسماح لها بالتعافي.

لزرع خلايا أولية أحادية الصفيحة السابقة للوتر بعد إزالة الأجنة كما هو موضح سابقا ، استخدم ماصة المراعي المصقولة بالنار لنقل ثلاثة أجنة من المتبرعين إلى طبق زرع خلية مليء بجرس خال من الكالسيوم بالقلم / البكتيريا العقدية. باستخدام ملاقط دقيقة لكل جنين ، قم بتشريح نبتة تحتوي على الخلايا المسماة ABP140 المحقونة وتخلص بسرعة من بقية الأجنة. باستخدام رمش ، حرك النباتات برفق حتى تنفصل الخلايا.

ثم ارسم خلية واحدة معزولة في إبرة الزرع وزرعها في درع جنين مضيف كما هو موضح سابقا في الفيديو. للتحكم الأمثل في الشفط والزرع ، حافظ على فصل الهواء / الماء على بعد حوالي 20 سم من نهاية الإبرة. لتركيب الأجنة ، املأ قارورة زجاجية سفلية بملليمتر واحد من 0.2٪ agarose الساخن في EM. ضع القارورة على حرارة 42 درجة مئوية في كتلة حرارية.

انقل جنينا محددا إلى محلول الاغاروز وتخلص من وسط الجنين الزائد من الماصة. ثم اسحب الجنين إلى الماصة باستخدام الاغاروز وانقله إلى غرفة تصوير معدة مسبقا مع قطرة من الاغاروز. قبل ضبط الاغاروز ، استخدم رمشا لتوجيه الجنين عن طريق وضع لوحة المنظور السابقة للوتر لأعلى للتصوير باستخدام مجهر مستقيم ، أو على قاع الزجاج للتصوير بالمجهر المقلوب.

سيكون هناك حوالي 40 ثانية لتوجيه الجنين قبل أن يتماسك هلام الاغاروز اعتمادا على درجة حرارة الغرفة. قم بتوجيه الجنين بسرعة عن طريق التلاعب بالأديم الأريمي بدلا من صفار البيض الهش للغاية. بعد تركيب جميع الأجنة وضبط الاغاروز ، استخدم Pen / Strep EM لملء الغرفة لمنع الأجنة من الجفاف.

إجراء تصوير الخلايا الحية وتجارب ديناميكيات الخلية وفقا لبروتوكول النص. تم استخدام التقنية الموضحة في هذا الفيديو لتحليل دور Sin1 ، أحد المكونات الأساسية لمركب TOR الثاني في التحكم في هجرة الخلايا في الجسم الحي. يعرض هذا الفيلم هجرة الخلايا السابقة للولادة في اللوحة السابقة للوتر المزروعة.

يسمح وضع العلامات على الأكتين بتصور النتوءات السيتوبلازمية الغنية بالأكتين. من خلال تحليل التردد والتوجيه ، لوحظ أن الخلايا البرية تنتج في كثير من الأحيان نتوءات سيتوبلازمية كبيرة ، موجهة في اتجاه القطب الحيواني ، والهجرة. كما هو موضح في هذا الشكل ، يؤدي فقدان وظيفة Sin1 إلى انخفاض كبير في عدد النتوءات والتوزيع العشوائي للنتوءات المتبقية مما يدل على أهمية Sin1 في التحكم في تكوين النتوء الغني بالأكتين.

ومن المثير للاهتمام أنه يمكن إنقاذ النمط الظاهري ل Sin1 عن طريق التعبير عن شكل نشط أساسي من Rac1 مما يشير بقوة إلى أن TOR C2 يتحكم في ديناميكيات الأكتين وتكوين نتوء الخلية من خلال Rac1. تم استخدام هذه التقنية أيضا لتحليل دور arpin ، وهو مثبط لمركب ARP2 / 3 في هجرة الخلايا. كما هو موضح هنا ، يؤدي فقدان وظيفة الأربين إلى زيادة في تواتر النتوء ، إما بسبب تكوين نتوء متكرر ، أو زيادة استقرار النتوء.

قياس عمر النتوء في غياب الأربين أن الثبات الزمني للنتوءات تضاعف مما يشير إلى زيادة في الاستقرار. بمجرد إتقان زرع حوالي 30 جنينا يمكن إجراؤه في 45 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراقبة تطور الأجنة لأن جميع الخطوات يتم توقيتها بشكل حرج.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر الحي لتوفير تصوير أفضل ومعالجة الأسئلة المتعلقة بتنظيم الخلايا الفرعية للعناصر الخلوية أو علامات القطبية أو بروتينات الإضافة أو أي مكون آخر للخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام عمليات زرع الألواح السابقة للوتر لتحليل دور أي جين مرشح في هجرة الخلايا في الجسم الحي.