Name: تحليل في فيفو الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: اكتشف تحليل وظيفة الجينات في الهجرة الخلوية باستخدام زرع الخلايا والتصوير الحي في أجنة سمك الزرد. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات التطور الجنيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر F. Bouallague ومنشأة IBENS للحيوانات على الرعاية الممتازة لأسماك الزرد. تم دعم البحث المبلغ عنه في هذا المنشور من قبل مؤسسة ARC pour la recherche sur le cancer ، منح N° SFI20111203770 و N° PJA 20131200143.

<ol><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+A+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model.</a> Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Dang, I., Gorelik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signalling+to+the+Arp2%2F3+complex+steers+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Dumortier, J. G., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TORC2+Component%2C+Sin1%2C+Controls+Migration+of+Anterior+Mesendoderm+during+Zebrafish+Gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation.</a> Plos One. 10, e0118474(2015).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+things%3A+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li>
<li>Ulrich, F., Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slb%2FWnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li>
<li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).</li>
<li>Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+patterns+the+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling patterns the organizer.</a> Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , (2000).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li>
<li>Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTrack%3A+An+open-source+software+for+cell+tracking+and+motility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis.</a> Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).</li>
<li>Tahinci, E., Symes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functions+of+Rho+and+Rac+are+required+for+convergent+extension+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation.</a> Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).</li>
<li>Zhang, T., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3-Efemp2a+modulates+the+fibrillar+matrix+for+cohesive+movement+of+prechordal+plate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors.</a> Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).</li>
<li>Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
<li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لدراسة دور الجينات مرشح في الهجرة خلية في الجسم الحي، من خلال الجمع بين خلق أجنة خيالية باستخدام زراعة الخلايا مع التصوير الحي. خلق الأجنة الفسيفساء دراسة ديناميات خلية يتطلب التصور من كفاف لتحليل ملحقات هيولي. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات خلايا معزولة في خلاف ذلك غير المسماة - أو المسمى بشكل مختل...

في الكائنات متعددة الخلايا، والهجرة الخلية الأساسية سواء بالنسبة للتطور الجنين حيث أنه يضمن تنظيم الخلايا في الأنسجة والأعضاء، ولحياة البالغين، حيث يشارك في توازن الأنسجة (التئام الجروح) والحصانة. وبالإضافة إلى هذه الوظائف الفسيولوجية، والهجرة الخلية هي أيضا متورطة في حالات المرضية المختلفة، بما في ذلك، على وجه الخصوص، الانبثاث السرطان. وقد تم تحليل هجرة الخلايا في المختبر لعقود من الزمن، وتوفير فهم شامل من الآليات الجزيئية ضمان الحركات خلية على الأسطح المستوية. في الجسم الحي ومع ذلك، تواجه الخلايا عن طريق بيئة أكثر تعقيدا. ويبدو واضحا في السنوات الماضية أن الهجرة داخل كائن حي قد يتأثر بعوامل خارجية مثل المصفوفة خارج الخلية، وخلايا أو كيموكينات يفرز الهجرة توجيه المجاورة، وأن آليات القيادة الهجرة الخلية قد تختلف من ما تم وصفه &lt;em&gt; في المختبر 1،2. وقد تلقى آليات ضمان في هجرة الخلايا المجراة اهتماما أقل حتى الآن، وذلك أساسا بسبب صعوبة التقنية وزيادة، مقارنة مع الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي يتطلب تحليل هجرة الخلايا على وجه الخصوص وصول البصرية مباشرة إلى الخلايا المهاجرة، وتقنيات لتسمية الخلايا فريدة من نوعها في لمعرفة ديناميتها والتشكل، وكذلك ربح أو خسارة وظيفة النهج لاختبار دور الجينات المرشحة. حتى الآن، وقد استخدمت سوى عدد قليل من النظم نموذج إيواء هذه الخصائص لتشريح الجسم الحي في خلية الهجرة 3. كنا مؤخرا هجرة لوحة القردودية المقدمة المحتملين في الأجنة الزرد الأولى كنظام نموذج مناسب الجديد لتقييم وظيفة الجينات مرشح في السيطرة في الجسم الحي خلية الهجرة 4،5. لوحة القردودية المقدمة المحتملين (المعروف أيضا باسم mesendoderm الأمامي) هي مجموعة من الخلايا التي تشكل في بداية جاستrulation على الجانب الظهري للجنين. خلال المعيدة هذه المجموعة تهاجر بشكل جماعي نحو القطب الحيواني من الجنين 6-8، لتشكل لوحة القردودية المقدمة، سماكة mesendodermal، الأمامي إلى الحبل الظهري، والكامنة لوحة العصبية. والجزء الأمامي من لوحة القردودية المقدمة تؤدي إلى الغدة الفقس، بينما الجزء الخلفي لها من المرجح أن يساهم لرئاسة الأديم المتوسط ​​9. بفضل التطور الخارجية والوضوح البصري للجنين الأسماك وهجرة الخلايا ويمكن ملاحظة مباشرة وبسهولة في هذا الهيكل. زرع الخلايا هي تقنية قوية جدا التي تسمح لخلق السريع والسهل للأجنة الفسيفساء 10. معربا عن علامات هيكل الخلية الفلورسنت في الخلايا المزروعة النتائج في وضع العلامات على الخلايا المعزولة، والتشكل وديناميكية والتي يمكن ملاحظتها بسهولة. الجمع بين هذا إلى الخسارة أو الربح من وظيفة النهج تصاريح تحليل وظائف خلايا مستقلة من علبةالجينات didate. يصف بروتوكول المعروضة كيف يمكننا تقييم وظيفة Sin1 عنصر TORC2 في السيطرة على الهجرة الخلية وأكتين ديناميكية في الجسم الحي 5. ولكن، كما هو مذكور في النتائج ومناقشتها أبعد من ذلك، يمكن استخدامها لتحليل الآثار المحتملة من أي الجينات مرشح في السيطرة على الهجرة خلية في الجسم الحي.

<table><tbody><tr><td>الشعيرات الدموية الزجاجية (القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.58 &nbsp ؛ مم)</td> <td>جهاز هارفارد</td><td>300085</td> الشعيرات الدموية <td>الزجاجية السماكة القياسية</td></tr><tr><td>(القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.78 مم)</td> <td>جهاز هارفارد</td><td>300085</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين</td> الرقيق الجدران <td>سيجما ألدريتش</td><td>P4333</td><td>10 & nbsp ؛ 000&nbsp; وحدات البنسلين و 10 & nbsp ؛ ملغم ستربتومايسين لكل مل</td></tr><tr><td>ملاقط دقيقة</td><td>أدوات العلوم الدقيقة Dumont</td><td>11254-20</td><td>أطباق</td></tr><tr><td>قاع زجاجية</td><td>5F MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>محول الهواء</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (للحقن)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (لزرع الخلايا)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton حقنة</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>مجتذب الماصات</td><td>الدقيقة David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>قالب الزرع</td> أدوات <td>العلوم</td><td>المساعد PT-1</td><td></td></tr><tr><td>حامل</td> <td>إبرة</td> موصل الأنبوب <td>Narishige HI-7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE</td><td>الأنابيب Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تعد هجرة الخلايا مفتاحا للعديد من الحالات الفسيولوجية والمرضية ، بما في ذلك ورم خبيث للسرطان. تم تحليل القواعد الخلوية والجزيئية لهجرة الخلايا بدقة في المختبر. ومع ذلك ، تختلف هجرة الخلايا في الجسم الحي بطريقة ما عن الهجرة في المختبر ، وقد أثبتت صعوبة تحليلها ، حيث تكون أقل سهولة في الوصول إلى المراقبة والتلاعب المباشرين. يستخدم هذا البروتوكول هجرة الصفيحة السابقة للوتر المحتملة في جنين الزرد المبكر كنظام نموذجي لدراسة وظيفة الجينات المرشحة في هجرة الخلايا. تشكل أسلاف الصفيحة السابقة للوتر مجموعة من الخلايا التي ، أثناء المعدة ، تخضع لهجرة موجهة من المنظم الجنيني إلى القطب الحيواني للجنين. يستخدم البروتوكول المقترح زرع الخلايا لإنشاء أجنة فسيفسائية. يوفر هذا المزايا المشتركة لوضع العلامات على الخلايا المعزولة ، وهو أمر أساسي للتصوير الجيد ، والحد من اكتساب / فقدان تأثيرات الوظيفة للخلايا المرصودة ، وبالتالي ضمان التأثيرات المستقلة للخلية. نصف هنا كيف قمنا بتقييم وظيفة مكون TORC2 Sin1 في هجرة الخلايا ، ولكن يمكن استخدام البروتوكول لتحليل وظيفة أي جين مرشح في التحكم في هجرة الخلايا في الجسم الحي.

وقد استخدمت هذه التقنية المقدمة إلى تحليل دور Sin1، واحدة من المكونات الأساسية للتور معقدة 2 (TORC2)، في السيطرة على الهجرة خلية الجسم الحي. استخدام زرع الخلايا يسمح بوضع العلامات على الخلايا المعزولة وتحليل الآثار خلية مستقلة. يظهر الفيلم S1 هجرة الخلايا الاولية لوحة القردودية المقدمة المزروعة. الأكتين وضع العلامات مع ABP140 يسمح التصور سهل من نتوءات هيولي الأكتين الغنية. قمنا بقياس وتيرتها والتوجه. البرية من نوع الخلايا تنتج الم...

من خلال الجمع بين زرع الخلايا ووضع العلامات على الهيكل الخلوي وفقدان / اكتساب مناهج الوظيفة ، يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام صفيحة ما قبل الحبل المحتملة لأسماك الزرد المهاجرة لتحليل وظيفة الجين المرشح في هجرة الخلايا في الجسم الحي.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل وظيفة جين مرشح في التحكم في هجرة الخلايا داخل الجسم الحي باستخدام زراعة الخلايا مقترنة بالتصوير الحي في جنين سمكة Zebrafish. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال هجرة الخلايا، مثل تحديد دور وأهمية الجينات المرشحة الجديدة في هجرة الخلايا داخل الجسم الحي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تُنتج أجنة موزاييكية، مما يتيح تصويراً جيداً وتتبعاً دقيقاً للخلايا.لتحضير إبر زراعة الخلايا، استخدم جهاز سحب الماصات الدقيقة لسحب شعيرة زجاجية. بعد ذلك، وبواسطة جهاز التشكيل الدقيق (microforge)، اقطع طرف الإبرة عند النقطة التي يكون فيها القطر الداخلي 35 micrometers. وباستخدام المطحنة الدقيقة، قم بشطف الطرف المقطوع من الشعيرة بزاوية 45 درجة.للتخلص من بقايا الزجاج، أدخل الإبرة في حامل إبر مثبت على حقنة، ثم استخدم حمض hydrofluoric بنسبة 2% لشطف الجزء الداخلي من الإبرة ثلاث مرات عن طريق سحب المحلول ودفعـه للخارج. بعد ذلك، اشطف الإبرة بالأسيتون ثلاث مرات. ولتجهيز الأطباق لعملية الحقن أو زراعة الخلايا، قم بتحضير agarose بنسبة 1% عن طريق تسخين 50 milliliters من وسط الأجنة الذي يحتوي على 0.5 grams من agarose في ميكروويف لمدة دقيقة واحدة بأقصى طاقة.بَرِّد هلام الأجاروز إلى حوالي 60 درجة مئوية واسكب الحجم كاملاً في طبق بتري بقطر 90 مليمتر. ضع قالباً لإنشاء خطوط للحقن أو لإنشاء آبار لزراعة الخلايا. وعندما يتماسك هلام الأجاروز، استخدم الملاقط لإزالة القالب.لحقن أجنة المانح، استخدم ملقطاً تحت المجهر المجسم لضغط الأجنة المعدلة وراثياً المجمعة برفق في صفوف طبق حقن مملوء بوسط الأجنة. وباستخدام الملقط، قم بتوجيه الأجنة بحيث تكون الخلايا نحو الأعلى، ثم حضن الطبق عند درجة حرارة 28 درجة مئوية حتى تصل الأجنة إلى مرحلة الخلية الرباعية. بعد ذلك، قم بتعبئة إبرة حقن بـ 2 µL من محلول حقن مُعد مسبقاً يحتوي على نطاق ربط الأكتين الخاص ببروتين ربط الأكتين في الخميرة 140 المرتبط بـ mcherry.بعد ذلك، أدخل الإبرة في حامل إبر متصل بمتحكم دقيق (micromanipulator) ومرتبط بجهاز حقن هوائي (air transjector). افتح الإبرة باستخدام ملقط دقيق للمس طرف الإبرة برفق أو عن طريق الضغط على طرفها. ثم أدخل الإبرة في إحدى الخلايا الأربع واحقن المحلول لملء 70% من حجم الخلية.قم بحقن 30 جنيناً بطريقة مماثلة. عندما تصل الأجنة إلى مرحلة الكرة، استخدم ماصة باستور بلاستيكية لنقل أجنة goosecoid GFP المعدلة وراثياً (المضيفة) والأجنة المانحة التي تم حقنها مسبقاً إلى أطباق بتري منفصلة مقاس 35 مليمتر، مغطاة بطبقة من الآجاروز بسمك واحد مليمتر في وسط جنيني ومملوءة بوسط جنيني يحتوي على Pen/Strep. وباستخدام ملاقط دقيقة، استخرج الأجنة يدوياً من أغشيتها الكوريونية.بعد ذلك، يتم وضع الأجنة في الحضانة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية. وعندما تصل الأجنة إلى مرحلة الدرع (shield stage) تحت المجهر الفلوري، يتم اختيار الأجنة المانحة التي تعبر عن ABP140 mcherry داخل الدرع الأخضر. وباستخدام ماصة باستير مصقولة بالنار، تُنقل الأجنة المضيفة إلى صف من الآبار في طبق زراعة الخلايا المعبأ بـ Pen/Strep EM. ثم يتم وضع الأجنة المانحة في الصف المجاور.بعد ذلك، وباستخدام رمش عين، قم بتوجيه الأجنة بعناية بحيث يكون الدرع للأعلى. ثم باستخدام حامل إبرة متصل بمحقنة، اشطف طرف الإبرة عن طريق سحب وطرد 70%ethanol. جفف الإبرة عن طريق سحب الهواء بداخلها.عندما تكون الإبرة جافة، أدخلها في حامل الإبر المتصل بمحقنة Hamilton بحيث يكون الشطب موجهاً للأعلى. لإجراء عملية نقل من الغلاف إلى الغلاف، أدخل إبرة النقل في غلاف جنين مانح واسحب حوالي 10 إلى 20 خلية موسومة بـ ABP140 mcherry. تجنب سحب المح بذلك بعناية.انقل الخلايا إلى درع الجنين المضيف وكرر عملية نقل الخلايا حتى يتم نقل جميع أجنة المضيف. عند اكتمال عملية النقل، استخدم ماصة باستور مصقولة بالنار لإزالة أي أجنة تالفة. قم بحضن الأجنة المنقولة عند 28 °C لمدة 30 دقيقة تقريبًا للسماح لها بالتعافي.لنقل خلايا أسلاف الصفيحة ما قبل الحبلية الفردية بعد إزالة الغشاء الكوريونى من الأجنّة كما تم توضيحه سابقاً، استخدم ماصة باستور مصقولة بالنار لنقل ثلاثة أجنّة مانحة إلى طبق نقل خلايا مملوء بمحلول رينجرز الخالي من الكالسيوم والمضاف إليه Pen/Strep. وباستخدام ملقط دقيق، قم بتشريح قطعة نسيجية من كل جنين تحتوي على الخلايا المحقونة والموسومة بـ ABP140 mcherry، وتخلص بسرعة من بقية الأجنّة. وباستخدام رمش اصطناعي، حرك القطع النسيجية بلطف حتى تتفكك الخلايا.بعد ذلك، اسحب خلية واحدة معزولة في إبرة الزرع وقم بزرعها في درع جنين مضيف كما تم توضيحه سابقاً في الفيديو. ولضمان التحكم الأمثل في عملية السحب والزرع، حافظ على مسافة الفصل بين الهواء والماء عند حوالي 20 سنتيمتراً من طرف الإبرة. لتثبيت الأجنة، املأ قارورة ذات قاع زجاجي بـ 1 مليمتر من agarose بتركيز 0.2% الساخن في وسط EM. ضع القارورة عند 42 درجة مئوية في كتلة تسخين.انقل جنيناً مختاراً إلى محلول الأجاروز وتخلص من وسط الأجنة الزائد من الماصة. بعد ذلك، اسحب الجنين داخل الماصة مع الأجاروز وانقله إلى غرفة تصوير مُعدة مسبقاً مع قطرة من الأجاروز. وقبل أن يتصلب الأجاروز، استخدم رمشاً لتوجيه الجنين عن طريق وضع الصفيحة ما قبل الوتدية (prechordal plate) للأعلى من أجل التصوير باستخدام مجهر قائم، أو وضعها على القاعدة الزجاجية للتصوير باستخدام مجهر مقلوب.سيكون هناك حوالي 40 ثانية لتوجيه الجنين قبل أن يتصلب هلام الأجاروز، وذلك اعتماداً على درجة حرارة الغرفة. قم بتوجيه الجنين بسرعة عن طريق تحريك السلائف الجنينية (blastoderm) بدلاً من المح، الذي يكون هشاً للغاية. بعد تثبيت جميع الأجنة وتصلب الأجاروز، استخدم Pen/Strep EM لملء الغرفة لمنع جفاف الأجنة.قم بإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية وديناميكيات الخلايا وفقاً للبروتوكول المكتوب. استُخدمت التقنية الموضحة في هذا الفيديو لتحليل دور Sin1، وهو أحد المكونات الأساسية لمعقد TOR الثاني، في التحكم في هجرة الخلايا داخل الجسم الحي. يوضح هذا المقطع هجرة الخلايا السلفية للصفيحة قبل الوترية المزروعة.يسمح وسم الأكتين بتصور البروزات السيتوبلازمية الغنية بالأكتين. ومن خلال تحليل التكرار والاتجاه، لوحظ أن الخلايا من النوع البري تنتج غالباً بروزات سيتوبلازمية كبيرة، موجهة نحو القطب الحيواني، وفي اتجاه الهجرة. وكما يتضح في هذا الشكل، فإن فقدان وظيفة Sin1 يؤدي إلى انخفاض حاد في عدد البروزات وعشوائية في اتجاه البروزات المتبقية، مما يثبت أهمية Sin1 في التحكم في تكوين البروزات الغنية بالأكتين.ومن المثير للاهتمام أن النمط الظاهري لـ Sin1 يمكن استعادته عن طريق التعبير عن شكل نشط بنيوياً من Rac1، مما يشير بقوة إلى أن TOR C2 يتحكم في ديناميكيات الأكتين وتكوين بروزات الخلية من خلال Rac1. وقد استُخدمت هذه التقنية أيضاً لتحليل دور arpin، وهو مثبط لمعقد ARP2/3 في هجرة الخلايا. وكما هو موضح هنا، فإن فقدان وظيفة arpin يؤدي إلى زيادة في تكرار البروزات، إما بسبب تكوين بروزات بشكل أكثر تكراراً، أو زيادة في استقرار هذه البروزات.كشف قياس عمر البروزات في غياب بروتين arpin أن الاستمرار الزمني للبروزات قد تضاعف، مما يشير إلى زيادة في الاستقرار. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء عملية نقل حوالي 30 جنيناً في غضون 45 دقيقة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراقبة تطور الأجنة بدقة لأن جميع الخطوات مرتبطة بتوقيتات حرجة.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر البؤري لعينات حية لتوفير تصوير أفضل ومعالجة التساؤلات المتعلقة بالتنظيم تحت الخلوي لعناصر الهيكل الخلوي، أو علامات القطبية، أو البروتينات المضافة، أو أي مكون خلوي آخر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام عمليات زرع سلائف الصفيحة أمام الحبال لتحليل دور أي جين مرشح في هجرة الخلايا داخل الجسم الحي.

analyzing-vivo-cell-migration-using-cell-transplantations-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

الزرد زرع الخلايا يمكن الجمع بين علم الوراثة وعلم الأجنة لتوليد نسيج الوهم محددة. هذا الفيديو يوضح المعيدة نظموا زرع الخلية التي سمحت مختبرنا للتحقيق في دور السكان astroglial والعظة توجيهات محددة خلال تشكيل الصوار في الدماغ المقدم.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

يصف هذا الفيديو طريقة حقن مجهرية لتوصيل خلايا سرطان الثدي إلى الفضاء المحيط الزجاجي لأجنة الزرد المعدلة وراثيا. بعد الحضانة ، نتخيل الجنين تحت المجهر الفلوري لمراقبة غزو الخلايا السرطانية وانتشارها ورم خبيث.

zPDX-تحليل الغزو: التحقيق في السلوك الغازي للخلايا السرطانية النقيلية في الطعوم الغريبة لجنين أسماك الزرد

المصدر: Williams, A. L., et al. تصوير الفوتون متعدد الفوتون لتصور التطور في الوقت الفعلي: تصور خلايا القمة العصبية المهاجرة في أجنة أسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2017)}يعرض هذا الفيديو بروتوكول تصوير بفاصل زمني متعدد الفوتون لتصور هجرة خلايا القمة العصبية في جنين الزرد في الوقت الفعلي بدقة عالية.

تصور هجرة خلايا القمة العصبية في جنين الزرد باستخدام التصوير بفاصل زمني متعدد الفوتون

الانقسام الحي أمر بالغ الأهمية لكل كائن حي وغالبا ما تؤدي العيوب إلى السرطان واضطرابات النمو. باستخدام بروتوكول التصوير هذا وسمك الزرد كنظام نموذجي ، يمكن للباحثين تصور الانقسام في كائن فقاري حي والعديد من العيوب التي تنشأ عندما تكون العمليات الانقسامية معيبة.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

هنا، نحن تصف نماذج الزرد طعم أجنبي باستخدام اثنين من مواقع الحقن المختلفة، أي الفضاء المحيط بالمح والقناة كوفييه، للتحقيق في السلوك العدواني وتقييم دخول الوعاء والتسرب إمكانات خلايا سرطان الثدي البشرية، على التوالي.

السلوك الغازية من خلايا سرطان الثدي البشرية في الجنينية الزرد

تتبع الحية الفردية الأسلاف شبكية العين WT في خلفيات وراثية متميزة يسمح لتقييم مساهمة الخلية إشارات غير المتمتعة بالحكم الذاتي خلال تكوين الخلايا العصبية. هنا، واستخدمت مجموعة من إسقاط الموروثة، وتوليد الوهم عن طريق زرع الجنين وفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لهذا الغرض.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة منذ وقت طويل لالتقاط التصوير عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للهجرة crest العصبي في تيراغرام (sox10:EGFP) والأجنة الزرد تيراغرام (foxd3:GFP).

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

وصفنا بروتوكولا لزرع الأجانب في صفار أجنة الزرد الشفافة التي يتم تحسينها بطريقة مرحلية بسيطة وسريعة. تشمل تحليلات ما بعد الحقن البقاء على قيد الحياة وتقييم عبء المرض للخلايا المزروعة بالأجانب عن طريق قياس التدفق الخلوي.

طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لتحليل زراعة الأعضاء في الأورام في أجنة الزرد الشفافة

نوضح طريقة تستفيد من الفحص المجهري متحد البؤر للمسح السريع لإجراء تصوير مباشر لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة في القفص البصري لسمك الزرد النامي ، مما يسمح بتحليل ديناميكيات هذه الخلايا في الجسم الحي.

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد

نقدم هنا بروتوكولا لزرع الخلايا بدقة مكانية وزمانية عالية في أجنة الزرد واليرقات في أي مرحلة بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب.

زرع الخلايا عالية الدقة في الزرد الجنيني واليرقات

اكتشف تحليل وظيفة الجينات في الهجرة الخلوية باستخدام زرع الخلايا والتصوير الحي في أجنة سمك الزرد. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات التطور الجنيني.

تحليل

استكشف المزيد من الفيديوهات