النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن المتصورة Sporozoites

الهدف العام لهذه المجموعة من الإجراءات هو تحصين الفئران بطفيليات المتصورة الموهنة للإشعاع. لتسهيل تحليل تجنيد الخلايا النخاعية في جلد الفأر وتصريف الغدد الليمفاوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الملاريا ، مثل ما هي الجهات الفاعلة الخلوية المشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية للطفيليات الحية الموهنة.

بين 18-25 يوما بعد وجبة دم العدوى ، جمع وتخدير البعوض المصاب في أنبوب 15 ملليلتر على الجليد. بعد ذلك ، اقلب الأنبوب بعناية في طبق بتري على الجليد وعرض الحشرات لجرعة 12 كيلوراد من جاما أو الإشعاع السيني. اجمع الغدد اللعابية للبعوض المشعة في 15 ميكرولترا من DPBS على الجليد.

وبعد ذلك ، سحق الغدد برفق لتحرير sporozoites. يعد حقن معلق طفيلي عالي التركيز بحجم صغير أمرا بالغ الأهمية ، لذلك من المهم حصاد عدد كاف من الغدد اللعابية من البعوض المصاب جيدا كما يتضح من التعبير القوي عن التألق الأخضر. أعد تعليق تعليق الطفيلي قبل الترشيح من خلال مصفاة 35 ميكرومتر مكيفة مع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

باستخدام غرفة العد المجهرية ، احسب العدد الإجمالي للبوغات المعزولة واضبط تعليق الطفيليات إلى 8.3 في عشرة إلى رابع sporozoites لكل تركيز ميكرولتر في DPBS البارد على الجليد. قبل حقن البوغات ، تأكد من المستوى المناسب من التخدير للحيوان التجريبي عن طريق قرصة إصبع القدم وقم بتطبيق مرهم العين لمنع جفاف القرنية. بعد ذلك ، عند العمل بسرعة ، استخدم شريطا شفافا لإصلاح الجانب البطني من صيوان الأذن برفق تحت مجهر استريو وتحميل حقنة سعة عشرة ميكرولتر ، مزودة بإبرة قياس 35 ، مع 0.6 ميكرولتر من الطفيليات المعلقة.

بعد ذلك ، أدخل الإبرة بعناية ، بحيث يكون الجانب المائل لأعلى ، أسفل البشرة على الجانب الظهري من الأذن وقم بحقن 0.15 ميكرولتر من البوغات في الموقع. ستلاحظ حطاطة مميزة في موقع الحقن. بعد حقن الأدمة ثلاث مرات أخرى ، كما هو موضح للتو ، قم بإزالة الشريط بعناية وراقب الماوس حتى يتم استرداده بالكامل.

في النقطة الزمنية المطلوبة بعد تلقيح البوغات ، ضحي بالفأر وابدأ الإجراء على الفور. تأكد من أن الفأر يظهر علامات الموت السريري. تطهير الأذن ومنطقة الرقبة المقابلة بنسبة 70 في المائة من الإيثانول.

بعد ذلك ، باستخدام مقص وملقط معقم ، قم بعمل شق في منطقة الوغولو الشرياني. ثم قم بتمديد الشق بملقطين لكشف العقدة الليمفاوية ذات المظهر الرمادي. قم بقرص وإزالة النسيج الضام مباشرة فوق العقدة الليمفاوية واستخرجه بزوج ثان من الملقط ، يوضع تحته.

انقل العقدة الليمفاوية إلى مصفاة 70 ميكرون في بئر واحد من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار ، تحتوي على 4.5 مل من الوسط القياسي ، مكملة بالكولاجيناز و DNase. بعد ذلك ، احصد الأذن الملقحة بالكامل واستخدم ملقطين لقرص الأذن وفصلها إلى الجوانب الظهرية والبطنية. ثم ضع كل جانب من جوانب الأذن في بئر من طبق ثان من ستة آبار ، يحتوي على 4.5 مل لكل بئر من الوسط المكمل بإنزيمات الجهاز الهضمي ، مع الحرص على أن يكون كل نسيج مغمورا تماما في الوسط.

لعزل الخلايا المناعية عن الغدد الليمفاوية ، احتضان صفيحة الأنسجة اللمفاوية عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون2 تحت التحريض اللطيف. بعد 15 دقيقة ، أضف عشرة مللي مولار EDTA إلى كل بئر وضع الطبق على الثلج. بعد ذلك ، لكل عقدة ليمفاوية ، استخدم نهاية مكبس حقنة جديد بحجم خمسة ملليمترات واضغط على العقدة الليمفاوية ضد المصفاة باستخدام حركات دائرية لفصل الأنسجة.

عندما يتبقى النسيج الضام الأبيض فقط ، اشطف المصفاة مرتين ب 500 ميكرولتر من DPBS التي تحتوي على FBS و EDTA وانقل الغسيل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد ذلك ، اغسل البئر مرتين أخريين باستخدام 500 ميكرولتر من DPBS المكملة وانقل الغسيل إلى الأنبوب الموجود على الثلج. لعزل الخلايا المناعية عن الأذن ، احتضن وريقات الأذن عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون2 مع تحريض لطيف.

بعد 20 دقيقة ، قم بتقطيع المناديل إلى قطع أصغر لتسهيل هضمها وإعادة العينات إلى الحاضنة. بعد 40 دقيقة ، أوقف عملية الهضم باستخدام عشرة مللي مولار EDTA وضع الطبق على الثلج. باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد بطرف مقطوع ، انقل محتويات كل بئر بالكامل إلى آبار جديدة تحتوي على مصافي 70 ميكرون.

واستخدم مكبس حقنة سعة خمسة ملليلتر لفصل شظايا أنسجة الأذن بحركات دائرية كما هو موضح للتو. عندما يتبقى النسيج الضام الأبيض والشعر فقط ، اغسل المصافي والآبار باستخدام DPBS بالإضافة إلى FBS و EDTA كما هو موضح للتو ، وقم بتجميع الغسالات في أنبوب سعة 50 مليلتر على الثلج. أخيرا ، اغسل البئر مرتين باستخدام DPBS المكملة وانقل الغسيل إلى الأنبوب الموجود على الثلج.

في هذا الفيديو ، يمكن رؤية هجرة البوغات المخففة بالإشعاع إلى جلد الفأر بعد 15 دقيقة من الحقن داخل الأدمة للطفيليات. بعد 24 ساعة من حقن البوغات داخل الأدمة ، يتم عزل الخلايا الكلية من الجلد وتصريف العقدة الليمفاوية. كما لوحظ في هذا الشكل ، يزداد تواتر الخلايا النخاعية في الجلد والعقدة الليمفاوية المستنزفة بشكل كبير مقارنة بالفئران الساذجة.

بمجرد إتقان ، يمكن إكمال الخطوات الأولى لبروتوكول تشعيع البعوض لحقن البوغات في غضون أربع ساعات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن البوغات المعزولة من الغدد اللعابية للبعوض تفقد عدويتها بسرعة. لذلك يجب حقنها في أسرع وقت ممكن.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا النخاعية من جلد الفأر وتصريف العقدة الليمفاوية لاستكشاف الاستجابة المناعية للحقن داخل الأدمة لطفيليات المتصورة الحية الموهنة.