تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية القيطم الكلى

الهدف العام من هذا الإجراء هو استهداف الحقن المجهري لكلية xenopus النامية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي مثل كيفية تشكل الكلى والجينات المهمة لهذه العملية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تزيد من توصيل الكواشف المحقونة الدقيقة إلى الأنسجة المستهدفة.

يعد تصور هذه الطريقة أمرا مهما لأن تحديد الأريمة الصحيحة للحقن المجهري المستهدف أمر بالغ الأهمية. لبدء هذا الإجراء ، تم عزل كلتا الخصيتين من ضفدع ذكر واحد ووضعهما في طبق بتري 60 ملم مملوء ب 10 ملليتر من محلول تخزين الخصيتين. ثم قم بتخزين الخصيتين عند أربعة درجات مئوية.

بعد ذلك ، تم جمع البيض من أنثى الضفدع في طبق بتري 100 ملم. اسكب الماء الزائد من طبق بتري. بعد ذلك قطع ربع الخصية في حل تخزين الخصيتين.

انقل قطعة الخصية إلى طبق بتري الذي يحتوي على البيض. بعد ذلك ، قم بتقطيع جزء الخصية إلى قطع صغيرة. أضف MMR بالإضافة إلى الجنتاميسين إلى طبق بتري لتغطية البيض.

امزجها عن طريق تحريك الطبق ثم انتظر حوالي 30 دقيقة حتى يتم الإخصاب في درجة حرارة الغرفة. بعد الإخصاب ، يجب أن يكون الجانب المصطبغ من الأجنة متجها لأعلى. قم بإزالة MMR من طبق بتري باستخدام ماصة نقل وأضف ما يكفي من محلول إزالة الهلام لتغطية الأجنة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الطبق خلال الدقائق القليلة التالية لإذابة طبقة الهلام على الأجنة. بمجرد أن تلامس الأجنة بعضها البعض عن كثب في وسط الطبق ، تتم إزالة طبقة الهلام. قم بإزالة محلول إزالة الهلام باستخدام ماصة النقل.

بعد ذلك ، اغسل الأجنة منزوعة الهلام من 3 إلى 5 مرات في MMR بالإضافة إلى Gentamycin عن طريق سكب MMR بعناية وملء الطبق ب MMR جديد. لا تقم بإزالة كل MMR من الطبق ، مما قد يؤدي إلى تلف الأجنة. بعد ذلك ، قم بإزالة أي بيض غير مخبب أو قطع من الخصية من طبق بتري.

لترتيب نموها ، ضع نصف الأجنة من إخصاب واحد في طبق بتري محفوظ عند 14 درجة مئوية ، والنصف الآخر من الأجنة في طبق بتري محفوظ عند 18 درجة مئوية. سوف تتطور الأجنة بشكل أبطأ عند 14 درجة مئوية مقارنة ب 18 درجة مئوية. السماح بمجموعات متعددة من الحقن من مخلب واحد مخصب.

تحضير محلول الحقن الذي يحتوي على النقطة صفر واحد نانوجرام لكل نانولتر من الرنا المرسال للبروتين الفلوري الأحمر المرتبط بالغشاء. بينما تتطور الأجنة إلى مرحلة 4 خلايا أو 8 خلايا. احتفظ بمحلول الحقن على الثلج حتى الاستخدام.

بعد ذلك ، قم بتحميل أنبوب شعري زجاجي بديل بحجم سبعة بوصات في مجتذب إبرة مع محاذاة الجزء العلوي من الأنبوب البديل مع الجزء العلوي من علبة مجتذب الإبرة. اضبط قيمة الحرارة رقم اثنين على 800 وقيمة السحب على 650 واضغط على زر السحب لسحب الإبرة. بعد ذلك ، قم بقص طرف الإبرة المسحوبة بزوج من ملقط دومون.

ضع كوليت الماصة الدقيقة على الجزء الخلفي من الإبرة. بعد ذلك ، ضع الحلقة O ذات الفتحة الكبيرة على الجزء الخلفي من الإبرة خلف الكوليت. الآن ، املأ الإبرة بالزيت المعدني باستخدام إبرة شديدة الجلد عيار 27 ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في الإبرة.

ضع الإبرة على مكبس الحاقن الدقيق ، واوضع الإبرة في الفتحة الكبيرة للفاصل البلاستيكي الأبيض المثبت على المكبس. قم بتأمين الإبرة عن طريق شد كوليت. بعد ذلك ، اضغط مع الاستمرار على زر Empty"" في مربع التحكم في الحاقن الدقيق حتى يكون هناك صوتان للصوت.

بعد ذلك ، قم بوضع ثلاثة ميكرولترات من محلول الحقن على قطعة من البارافيلم ثم أدخل طرف الإبرة في حبة محلول الحقن على البارافيلم. اضغط مع الاستمرار على زر Fill "في صندوق التحكم في الحاقن الدقيق لسحب محلول الحقن إلى الإبرة.

قبل الحقن المجهري ، من المهم فهم الانقسامات الخلوية المبكرة لجنين xenopus. يحتوي جنين الخلية المفردة على عمود حيواني مصطبغ داكن وقطب نباتي أبيض وعصي. في جنين الخليتين ، يحدث الانقسام الأول عادة بين الجانبين الأيسر والأيمن من الجنين.

تساهم هذه الخلايا بالتساوي في النسب الكبي. يقسم الانقسام الثاني النصفين الظهري والبطني للجنين مما يؤدي إلى جنين مكون من 4 خلايا. الخلايا الظهرية أصغر حجما ولها صبغة أقل من الخلايا البطنية.

في حالة الحقن في جنين مكون من 4 خلايا ، قم بحقن الأريمة البطنية اليسرى لاستهداف الكلية اليسرى. الانقسام الثالث يقسم الجانبين الحيواني والنباتي. ينتج عنه جنين مكون من 8 خلايا.

في هذه المرحلة ، هناك أربعة بلاستوميرات حيوانية وأربعة بلاستوميرات نباتية. لاستهداف الكلية اليسرى لجنين مكون من 8 خلايا ، يتم حقنها في الأريمة النباتية البطنية اليسرى. بعد ذلك ، املأ طبق بتري مقاس 60 ملم مبطن بشبكة بوليستر 500 ميكرون مع خمسة بالمائة من الفايكول في MMR بالإضافة إلى الجنتامايسين.

ضع الماصة بعناية من 20 إلى 30 جنينا مكونة من 8 خلايا في الطبق. باستخدام حلقة الشعر ، قم بمعالجة الأجنة بحيث يكون الأريمة المراد حقنها في مواجهة الإبرة. لاستهداف الكلية اليسرى ، اصطف الأجنة بحيث تواجه الأريمة النباتية البطنية اليسرى المكونة من 8 خلايا الإبرة.

حقن 10 نانولترات من محلول الحقن في الأريمة المختارة لكل جنين في الطبق. بعد ذلك ، انقل الأجنة المحقونة إلى آبار صفيحة الاستزراع مع خمسة بالمائة من fycol في MMR بالإضافة إلى الجنتامايسين. احتضان الأجنة المحقونة عند 16 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين تقريبا للسماح للبلاستوميرات المحقونة بالشفاء.

بعد ذلك ، انقل الأجنة المحقونة إلى آبار جديدة في صفيحة الثقافة المملوءة ب MMR بالإضافة إلى الجنتامايسين. احتضان الأجنة عند درجة حرارة 14 إلى 22 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة 38 إلى 40. في هذا الإجراء ، قم بنقل 10 إلى 20 المرحلة من 38 إلى 40 جنينا في قارورة زجاجية.

أضف 10 ميكرولترات من خمسة بالمائة من البنزوكايين في 100 في المائة من الإيثانول إلى القارورة. امزج عن طريق قلب القارورة وانتظر 10 دقائق لتخدير الأجنة. بعد ذلك ، قم بإزالة MMR من القارورة واملأها ب MEMFA.

ثم ضعه على منصة هزازة ثلاثية الأبعاد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، أخرج MEMFA من القارورة واملأها بالميثانول بنسبة 100٪. ثم ضع القارورة على منصة هزازة ثلاثية الأبعاد لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

كرر خطوة الغسيل هذه مرة أخرى وقم بتخزين الأجنة في 100 في المائة من الميثانول طوال الليل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. الأجنة الآن ثابتة وجاهزة للتلوين المناعي. يوضح هذا التخطيطي أي بلاستومير يجب حقنه لاستهداف العقبات اليسر لأجنة xenopus في المرحلة المكونة من 8 خلايا باستخدام بروتين الفلورسنت الأحمر المرتبط بالغشاء كمتتبع.

موقع التتبع بعد الحقن في الأريمة النبوية البطنية اليسرى باللون الأحمر بينما يتم تمييز الكلية باللون الأخضر. تظهر هذه الصورة أن الكلية كانت ملطخة باللون الأخضر بالأجسام المضادة 3G8 و 4A6. فيما يلي منظر عن قرب لمنطقة الكلى تظهر التباطؤ التتبع وهنا الصورة المدمجة التي توضح التوطين المشترك للمتتبع مع الكلى.

تظهر هنا الصورة متحدة البؤر لكلية جنين ثان ملطخ ب 3G8 و 4A6. هذا هو توطين المتتبع الأحمر في الكلى والأنسجة المحيطة بها وهذه هي الصورة المدمجة التي توضح التوطين المشترك للمتتبع 3G8 و 4A6 في الكلى. قبل إجراء هذا الإجراء ، من المهم أن تتعرف على جنين xenopus المبكر.

سيسمح لك ذلك باستهداف الحقن المجهري بشكل صحيح من خلال خريطة تلاشي xenopus المعمول بها. بمجرد إتقانها ، يمكن تكييف هذه التقنية لاستهداف الأنسجة الأخرى مثل الأنبوب العصبي أو القلب.