التغليف السيتوكروم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تغليف السيتوكروم c في هلامات السيلكا (Silical sol-gels)، ومعالجة هذه الهلامات في ظروف فوق حرجة لتكوين هلامات هوائية حيوية (bio aerogels)، واستخدام هذه الهلامات الهوائية الحيوية للتعرف السريع على أكسيد النيتريك من خلال تفاعل في الطور الغازي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات الاستشعار الحيوي والتحليل الحيوي، مثل ما هي الظروف الضرورية لبقاء السيتوكروم c نشطاً عند تغليفه في هلام هوائي عالي المسامية؟

تكمن أهمية هذه التقنية في أنها إجراء بسيط لتغليف البروتين داخل مصفوفة لم ينجح تغليف البروتينات فيها في كثير من الأحيان. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول السيتوكروم سي (cytochrome c)، إلا أنها قد تؤدي أيضاً إلى تطويرات إجرائية لتغليف بروتينات أخرى في الهلام الهوائي (aerogels)، مما قد يكون له أهمية كبيرة في الأجهزة التحليلية الحيوية المستقبلية. قم بتحضير محلول بتركيز Cytochrome c يتراوح بين 0.7 إلى millimolar.

بالإضافة إلى محلول السيتوكروم c المخفف بتركيز 0.105 millimolar، كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، ضع ملصقاً على كأساً من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter للاستخدام لمرة واحدة، وسمّه "الكأس A". ضع الكأس على كفة ميزان تحليلي، واستخدم ماصة باستور زجاجية لإضافة 1.88 grams من رباعي ميثوكسي سيلان إلى الكأس. ثم قم بتصفير الميزان.

ثم يتم نقل 2.88 grams من methanol إلى Beaker A باستخدام الماصة. يتم تغطية Beaker A باستخدام parafilm. بعد ذلك، يُضاف قضيب تحريك مغناطيسي إلى كأسا بولي بروبيلين مخصص للاستخدام مرة واحدة سعة 50 milliliter وموسوم بـ Beaker B، ويوضع على كفة ميزان تحليلي. تُستخدم ماصة زجاجية لإضافة 0.75 grams من الماء، و 3.00 grams من methanol قبل تغطية Beaker B باستخدام parafilm.

ابدأ بتقليب محتويات الكأس B على لوح تقليب داخل خزانة استخلاص الغازات. بعد ذلك، استخدم سرنجة لإضافة 5 µL من محلول هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 28.0 إلى 30.0% عبر غطاء البارافيلم إلى الخليط مع الاستمرار في التقليب. وبمجرد اكتمال هذه الخطوة، أضف محتويات الكأس A إلى الكأس B. قلّب الخليط لمدة 20 دقيقة مع إبقائه مغطىً بالبارافيلم.

أثناء خلط مزيج سول السيليكا، أحضر ثماني إلى تسع قوارير وميضية من البولي بروبيلين مع الأغطية المقابلة لها. ضع غلافاً بلاستيكياً فوق طرف غطاء القارورة لإنشاء سطح مستوٍ يتشكل عليه الهلام، ثم ضع الغطاء فوقه.

التأكد من بقاء الغلاف البلاستيكي سليمًا داخل الغطاء. قم بمحاذاة الأنابيب بحيث تكون نهاية الغطاء متجهة لأسفل على سطح المختبر، والقواعد المفتوحة متجهة للأعلى. بعد ذلك، قم بقص قطع من الـ parafilm التي ستُستخدم لتغطية كل أنبوب.

عند الانتهاء من خلط السول، أضف 3 milliliters من خليط السول إلى كأٍس بولي بروبيلين نظيفة ومخصصة للاستخدام لمرة واحدة سعة 50 milliliter. استخدم ماصة باستور زجاجية لإضافة 500 microliters من محلول السيتوكروم c المخفف بتركيز 0.105 millimolar ببطء شديد على جدار الكأس إلى خليط السول (3 milliliter) على مدار دقيقة واحدة تقريباً. تأكد من تدوير الخليط بلطف أثناء إضافة السيتوكروم c لتجنب تكوين تكتلات حمراء كبيرة.

انقل باستخدام الماصة 0.5 milliliters من محلول السليكا سول الناتج عن السيتوكروم c إلى كل قالب مُعد. كما يتم نقل 0.5 milliliters من محلول السليكا سول العادي المتبقي إلى قالب واحد أو قالبين لاستخدامهما كعينات ضابطة أثناء عملية التجفيف فوق الحرجة. غطِ الفتحات العلوية للقوالب باستخدام شريط البارافيلم، وضعها في الثلاجة طوال الليل، أو لمدة 12 ساعة على الأقل لإنتاج هلام السول (sol gels).

أخرج القوالب من الثلاجة. قم بإزالة شريط البارافيلم من أعلى أحد القوالب التي تحتوي على هلام السيتروكروم c (cytochrome c sol gel)، وكذلك إزالة الغطاء والغلاف البلاستيكي من الأسفل. بعد إضافة القليل من الإيثانول من زجاجة الغسيل داخل القالب، استخدم الطرف القرصي الدائري لمكبس المحقنة لدفع الهلام بعناية خارج القالب وإدخاله في قارورة وميض زجاجية نظيفة سعة 20 milliliter تحتوي على 5 milliliters تقريبًا من الإيثانول.

كرر إجراء إزالة الهلام هذا حتى يتم إضافة جميع هلامات cytochrome c إلى القارورة، وإضافة جميع هلامات السيليكا إلى قارورة منفصلة. ثم املأ القوارير حتى الأعلى بالإيثانول. أغلق القوارير بإحكام واحفظها في درجة حرارة تتراوح بين 2 و 8 °C.

أخرج الهلامات من الثلاجة كل أربع ساعات طوال اليوم. قم بتصريف الإيثانول من الهلامات، واستبدله بإيثانول جديد. وخلال ثلاثة أيام إضافية، اغمر هلامات السول الرطبة في الأسيتون، مع تصريف الأسيتون وإضافة أسيتون جديد ثلاث مرات يومياً.

قم بتبريد جهاز تجفيف بالنقطة الحرجة إلى 10 degrees celsius، وذلك بضبط درجة حرارة جهاز تدوير متصل على ثماني درجات مئوية. وبمجرد أن يصل الجهاز إلى 10 degrees celsius، أجرِ اختبار تسريب للجهاز كما هو موضح في البروتوكول النصي. وبعد التأكد من خلو الجهاز من التسريبات، اسكب الهلامات الرطبة بعناية من قوارير الوميض، مع معظم الأسيتون، في الأقسام الثلاثة الطويلة لقارب النقل.

أضف المزيد من الأسيتون إذا لزم الأمر لضمان غمر جميع الهلامات تماماً في الأسيتون قبل إغلاق الوعاء داخل الجهاز. افتح صمام التعبئة الخاص بالجهاز لإضافة ثاني أكسيد الكربون. عند ملاحظة هبوط ثاني أكسيد الكربون إلى قاع الجهاز من خلال نافذة الجهاز، افتح صمام التصريف لتصريف الأسيتون لمدة خمس دقائق.

سيحدث هذا التسرب للأسيتون إلى القاع قبل أن يمتلئ الجهاز تماماً بثاني أكسيد الكربون. لذا، حافظ على صمام الملء مفتوحاً أثناء عملية التصريف لضمان استمرار امتلاء الجهاز. بعد ذلك، أغلق صمام التصريف.

أبقِ صمام التعبئة مفتوحاً قليلاً. في البداية، يحتوي المزيج الذي يتم تصريفه على ماء، لأن الأسيتون ليس لامائياً. ومن المحتمل حدوث تجمد أو انسداد أو تراكم للضغط في أنبوب التصريف.

في حال اكتشاف انسداد، أغلق صمام التصريف حتى يذوب الانسداد. بعد خمس دقائق، افتح صمام التصريف لمدة خمس دقائق إضافية، واضبط صمام الملء ليكون مفتوحاً بما يكفي لضمان بقاء الجهاز ممتلئاً طوال فترة التصريف. بعد مرور خمس دقائق، أغلق صمام التصريف وأبقِ صمام الملء مفتوحاً قليلاً.

بعد ذلك، كرر خطوة التصريف هذه مرة أخرى بعد مرور خمس دقائق. وبمجرد اكتمال خطوات التصريف، أغلق صمام التعبئة، وقم بتصريف ثاني أكسيد الكربون السائل بحيث يظل المستوى مرئياً فوق أسنان القارب مباشرة عبر نافذة الجهاز. بعد ذلك، اضبط درجة حرارة جهاز التدوير الملحق بالجهاز على 40 °C للتأكد من أن ثاني أكسيد الكربون السائل يرتفع فوق درجة حرارته وضغطه الحرجين.

بعد مرور 15 دقيقة تقريباً، لاحظ الانتقال من الحالة السائلة إلى المائع فوق الحرج من خلال نافذة الجهاز بينما يختفي السطح الهلالي للسائل فوق أسنان القارب. بعد فترة توازن لا تقل عن 15 دقيقة، افتح صمام التنفيس قليلاً لبدء تحرير المائع فوق الحرج. وعلى مدار 45 دقيقة تقريباً، استمر في فتح صمام التنفيس تدريجياً وبشكل متزايد حتى يُسمع صوت فحيح ثابت ومنخفض جداً للمائع المتحرر، ويُلاحظ انخفاض مؤشر الضغط ببطء حتى يصل إلى الصفر.

بعد أن ينخفض ضغط الجهاز إلى الصفر، افتح باب الجهاز. أخرج القارب، واستخدم الملاقط لوضع الهلامات الهوائية (aerogels) المجففة حديثًا في قوارير وميض زجاجية نظيفة.

أصبحت هلامات السليكا الهوائية المحتوية على السيتوكروم ج (cytochrome c) الآن جاهزة للاستخدام للكشف عن وجود غاز أكسيد النيتريك، وذلك بعد إجراء التوصيف كما هو موضح في البروتوكول النصي. تظهر في الصورة هلامات هوائية تغلف 15 micromolar من السيتوكروم ج (cytochrome c) في محاليل منظمة من فوسفات البوتاسيوم بتركيزات 4.4 millimolar و 40 millimolar و 70 millimolar، وذلك مقارنةً بعملة من فئة dime. يظهر هنا طيف ممثل للسيتوكروم ج (cytochrome c) في المحلول المنظم مقارنةً بالسيتوكروم ج (cytochrome c) المغلف في هلامات هوائية تحت ظروف متنوعة.

تظل ذروة سوريت (soret peak) للسيتوكروم ج (cytochrome c) عند 409 نانومتر دون تغيير جوهري داخل الهلاميات الهوائية (aerogels)، وتظهر إزاحة حمراء مميزة عند تعريض الهلاميات الهوائية الحيوية لـ أكسيد النيتريك في الحالة الغازية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تخليق هلامات السيليكا السائلة (silica sol gels)، وتغليف السيتوكروم ج داخل هذه الهلامات السائلة، وتجفيف هذه الهلامات السائلة المركبة لتحويلها إلى هلاميات هوائية. يمكن العثور على مزيد من المعلومات في البروتوكول النصي حول توصيف الهلاميات الهوائية الحيوية، واستخدامها للكشف عن أكسيد النيتريك في الحالة الغازية.