اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا ميلانينية ناضجة ومصبغة بالكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد العوامل الرئيسية أثناء تطور الخلايا الميلانينية. بالإضافة إلى ذلك، سيمكننا هذا البروتوكول من تحديد العوامل التي اختلت أثناء تطور المرض، فضلاً عن فحص الأدوية الهامة وأثناء عملية اكتشاف الأدوية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه يمكننا من إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الميلانية كاملة التصبغ، بينما يؤدي عزل الخلايا الميلانية من المرضى عادةً إلى الحصول على عدد قليل نسبياً من الخلايا. بعد تقسيم وتجميد البروتين الجيلاتيني، يتم إذابة وإعادة تعليق حصة مقدارها 1 ml في 19 ml من DMEM f12.

بعد ذلك، قم بإضافة خمسة مليلترات من هذا الخليط إلى طبق زراعة أنسجة واحد بقطر 10 سنتيمتر. وبعد تحضير عدة أطباق مماثلة، ابدأ بحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ابدأ في تحضير الأطباق المطلية بـ PO واللامينين والفيبرونكتين عن طريق إضافة PBS يحتوي على 15 ميكروغرام لكل مليلتر من PO إلى طبق زراعة.

بعد ذلك، تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة. بعد ذلك، يتم شفط المحلول وغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام 1X PBS. استمر في عملية الطلاء بإضافة 10 milliliters من PBS الذي يحتوي على one microgram per milliliter من mouse laminin 1 و two micrograms per milliliter من fibronectin.

بعد ذلك، يتم تحضين الأطباق كما تم وصفه سابقاً. في البداية، أضف gelatin بنسبة 0.1% في PBS إلى طبق بقطر 10 سنتيمتر. ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بينما يتم طلاء هذا الطبق، ضع الخلايا الليفية الجنينية للفأر المجمدة (MEFs) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C لإذابتها بسرعة. بعد ذلك، اسحب الجيلاتين من الطبق وازرع خلايا MEFs بكثافة تبلغ حوالي 50,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط DMEM مضاف إليه 10% من مصل البقر الجنيني. بعد تحضين الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C، اسحب الوسط واغسل طبق MEF المجهز باستخدام 1X PBS.

أضف 10 milliliters من وسط hESC الذي تم تحضيره مسبقًا ويحتوي على خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات والتي يُرمز لها اختصارًا بـ hPSCs، إلى طبق بقطر 10 centimeter. بعد استزراع الخلايا بكثافة 5 مليون خلية لكل طبق، قم بحضن الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة Celsius في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون. استمر في تغذية الخلايا يوميًا بـ 10 milliliters من وسط hESC الطازج.

قبل البدء في عملية التمايز، افحص الطبق بحثاً عن أي مستعمرات يبدو أنها تحتوي على خلايا متمايزة، أو ذات حدود غير منتظمة، أو مراكز شفافة. وباستخدام مجهر تشريحي داخل غطاء تدفق صفائحي، قم بإزالة أي من هذه المستعمرات غير المنتظمة ميكانيكياً باستخدام ماصة. ولإجراء عملية الطلاء ببروتين جيلاتيني مثل Matrigel، قم أولاً بتقسيم البروتين إلى حصص وتجميدها في أجزاء سعة 1 mL لتجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة.

بعد ذلك، قم بإذابة وإعادة تعليق جزء مجمد بحجم 1 ml في 19 ml من DMEM f12. ثم ابدأ بوضع 5 ml من هذا المزيج في طبق قطر 10 cm وحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد ذلك، قم بشفط البروتين الهلامي مباشرة قبل زراعة الخلايا واغسل الطبق باستخدام DMEM F12. وأثناء عملية طلاء هذا الطبق، اختر طبقاً تكون فيه hPSCs قد وصلت إلى درجة تلاقي تبلغ 80% تقريباً.

باشِر بشفط وسط زراعة hESC، ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS. وبعد إزالة PBS، أضف ثلاثة مليليتر من 0.05%trypsin-EDTA إلى الطبق.

استمر في رج الطبق بقوة بشكل أفقي لمدة دقيقتين حتى يُلاحظ تحت المجهر أن خلايا MEFs قد بدأت في الانفصال كخلايا مفردة. خلال هذه الفترة، من المتوقع أن تظل مستعمرات hPSC ملتصقة بالطبق. ثم قم بشفط التريبسين بمجرد انفصال خلايا MEFs وقبل أن تنفصل مستعمرات hPSC.

بعد ذلك، أضف إلى الطبق 10 milliliters من وسط hESC الذي يحتوي على 10 micromolar من Y-27632 dihydrochloride، وهو مثبط لـ ROCK. بعد ذلك، قم بفصل الخلايا عن طريق السحب والضخ بالماصة فوق المستعمرات. ثم عد إلى الطبق الذي يحتوي على البروتين الجيلاتيني وقم بشفط المحلول.

اغسل هذا الطبق باستخدام DMEM f12 لإزالة أي تكتلات. ثم ازرع فيه hPSCs بنسبة 1 إلى 2. بعد ذلك، أضف إلى الطبق وسط hESC الذي يحتوي على 10 micromolar من Y-27632 dihydrochloride حتى يصل الحجم إلى 10 milliliters.

قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل. غَذِّ الخلايا يومياً بوسط مُدعم بمثبط ROCK. عندما تصل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى درجة تلاقي 80%، ابدأ في عملية التمايز العصبي واعتبر هذه النقطة الزمنية هي اليوم 0.

لبدء عملية التمايز، يتم تغذية الخلايا في اليوم 0 واليوم 1 بـ 10 milliliters من وسط تمايز KSR الذي يحتوي على 100 nanomolar من LDN-193189، وهو مثبط لـ MP، و 10 micromolar من SB 431542، وهو مثبط لـ activin و Nodal. ثم يستمر العمل في اليوم 2 باستبدال الوسط بآخر يحتوي على نفس تركيزات مثبطات BNP و activin و Nodal، بالإضافة إلى ثلاثة micromolar من CHIR99021، وهو منشط لـ Wnt. بعد ذلك، في اليوم 3، يتم تغذية الخلايا بوسط تمايز KSR المدعم فقط بـ 10 micromolar من SB 431542 وثلاثة micromolar من CHIR99021.

بعد تحضير خليط من وسط تمايز KSR بنسبة 75% ووسط تمايز N2 بنسبة 25% والذي يحتوي أيضاً على 3 µM من منشط Wnt، يتم تغذية الخلايا بـ 15 milliliters من هذا السائل في اليومين 4 و5. بعد ذلك، في اليومين 6 و7، يتم تغذية الخلايا بـ 15 milliliters من وسط يتكون من 50% وسط تمايز KSR و50% وسط تمايز N2، والذي تم تدعيمه أيضاً بـ 3 µM من CHIR99021 و25 ng/mL من BMP4 و100 nM من EDN3.

بعد ذلك، وفي اليومين 8 و9، يتم تغذية الخلايا بـ 20 milliliters من وسط تمايز يتكون من 25%KSR و75%N2، مُدعم بنفس تركيزات العوامل المستخدمة في اليومين 6 و7. يتم المتابعة في التمايز العصبي في اليوم 10 عن طريق تغذية الخلايا بـ 20 milliliters من وسط تمايز N2 يحتوي على 3 micromolar من CHIR99021 و25 nanograms per milliliter من BMP4 و100 nanomolar من EDN3. وفي اليوم 11، يتم سحب المحلول من الأطباق التي تم طلاؤها مسبقاً بـ PO lamanin 1 وfibronectin.

بعد ذلك، تُترك الأطباق مكشوفة في غطاء زراعة الأنسجة لمدة تتراوح تقريباً بين 10 إلى 15 دقيقة حتى تجف تماماً. ثم يتم إزالة الوسط من خلايا اليوم 11 وغسلها باستخدام PBS. بعد ذلك، يُضاف 4 mL من محلول فصل الخلايا إلى الطبق ويُحضن عند 37 °C لمدة 25 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضن، أضف خمسة ملليلترات من وسط الخلايا الميلانينية الكامل إلى الطبق. ثم أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والضخ يدوياً باستخدام الماصة حتى تنفصل الخلايا عن الطبق. انقل المعلق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر وقم بتدوير الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 Gs. بعد عد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد صبغة Trypan Blue ومقياس كرات الدم hemocytometer، أعد تعليقها في وسط الخلايا الميلانينية الكامل بكثافة 2X10⁶ خلية لكل ملليلتر.

قم بتوزيع قطرات بحجم 10 microliter من معلق الخلايا على الأطباق المجففة والمطلية. تأكد من أن القطرات متقاربة ولكن غير متلامسة، وأن حوافها محددة جيداً ولا تنساب. للسماح للخلايا بالالتصاق، اترك القطرات في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك، أضف ببطء 10 milliliters من وسط الخلايا الميلانينية الكامل (full melanocyte medium) إلى الطبق مع الحرص على عدم تحريك الخلايا الملتصقة. ثم، انقل الطبق إلى الحاضنة. قم بتغذية الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام وسط الخلايا الميلانينية الكامل.

ومن المتوقع ملاحظة التصبغ في مجموعات من الخلايا بنهاية الأسبوع الأول. ومرة واحدة أسبوعياً، قم بنقل الخلايا عن طريق معالجتها أولاً بمحلول فصل الخلايا كما تم وصفه سابقاً. وبعد جمع الخلايا وطردها مركزياً، اغسلها مرتين باستخدام وسط neurobasal بسيط.

بعد ذلك، أعد زراعة الخلايا بنسبة واحد إلى ستة في وسط الخلايا الميلانينية الكامل على أطباق مغطاة بـ PO، وlamanin 1، وfibronectin. وبحلول اليوم 30 تقريبًا من التمايز، ستظهر الخلايا مصبغة بشكل عميق، وهو أمر يمكن ملاحظته بسهولة عند زراعتها بكثافة عالية أو عند تجميعها في كريات أثناء عملية النقل.

تظهر هنا صورة بالمجهر الضوئي (bright field) لخلايا من خط خلايا جذعية جنينية بشرية محولة جينيًا psox10 GFP، تم استزراعها حتى اليوم 11 من بروتوكول التمايز الموصوف قبل إعادة زراعة الخلايا. وتظهر في هذه المزارع نتوءات داكنة ومحددة من الخلايا. وعندما تم تقييم هذه المزارع للكشف عن إشارة GFP، تبين أن هذه النتوءات الداكنة كانت غنية بالخلايا الإيجابية لـ sox10.

بما أن sox10 هو عامل نسخ يزداد تنظيمه بواسطة الخلايا الجذعية للعُرف العصبي ويتم الحفاظ عليه في الخلايا الميلانينية الأولية، فإن هذه النتائج تشير إلى أن طريقة التمايز هذه قد أدت بحلول اليوم 11 إلى إثراء الخلايا التي ستؤدي في النهاية إلى ظهور الخلايا الميلانينية. ودليلاً على ذلك، فقد احتوت المزارع بحلول اليوم 20 من البروتوكول على خلايا ميلانينية غير صبغية، وأخرى في طور النضج، وخلايا ميلانينية صبغية ناضجة تماماً. وفي اليوم 25، لوحظت الأنواع نفسها من الخلايا في المزارع.

يتم تأكيد وجود الخلايا الميلانينية الناضجة والمصبغة في هذه التحضيرات من خلال الصبغ باستخدام بروتينين من بروتينات إنتاج الميلانين: TYRP2، الذي يعمل كعلامة لكل من الخلايا الميلانينية الأولية والخلايا الميلانينية، وTYRP1 الذي يعد علامة لمرحلة متأخرة من الخلايا الميلانينية ولا يتم التعبير عنه هنا إلا في الخلايا الميلانينية المصبغة. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن استخدامه لتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا ميلانينية ناضجة ومصبغة بالكامل خلال 25 يوماً.

يمر البروتوكول بمراحل تطور الخلايا الميلانينية الطبيعية من خلال المرور أولاً بحالة العرف العصبي وكذلك مرحلة الخلايا الميلانينية البدائية.