اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا ميلانينية ناضجة ومصطبغة بالكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد العوامل الرئيسية أثناء تطور الخلايا الصباغية. بالإضافة إلى ذلك ، سيمكننا هذا البروتوكول من تحديد العوامل التي انحرفت عن مسارها أثناء تطور المرض ، بالإضافة إلى فحص الأدوية المهمة وأثناء اكتشاف الأدوية.

الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يمكننا من إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا الصباغية المصطبغة بالكامل. في حين أن عزل الخلايا الصباغية عن المرضى عادة ما ينتج عنه عدد قليل نسبيا من الخلايا. بعد نقل البروتين الجيلاتيني وتجميد ، قم بإذابة وإعادة تعليق كمية ملليلتر واحدة في 19 مل من DMEM f12.

ثم أدخل خمسة ملليلتر من هذا الخليط في طبق واحد لزراعة الأنسجة 10 سم. بعد إعداد العديد من هذه اللوحات ، استمر في احتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ابدأ في تحضير الأطباق المطلية بالفوز واللامينين والفيبرونيكتين عن طريق إضافة PBS أولا الذي يحتوي على 15 ميكروغرام لكل مليلتر من الفميين إلى طبق الاستزراع.

ثم احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة. بعد ذلك ، قم بشفط المحلول وغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام 1X PBS. استمر في الطلاء بإضافة 10 ملليلتر من PBS تحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر من لامينين الفأر 1 وميكروغرامين لكل مليلتر من الفيبرونكتين.

ثم احتضن الأطباق كما هو موضح سابقا. للبدء ، أضف 0.1٪ جيلاتين في PBS إلى طبق 10 سم. واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أثناء طلاء هذه اللوحة ، ضع الخلايا الليفية الجنينية المجمدة للفأر ، أو MEFs في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لإذابتها بسرعة. بعد ذلك ، قم بشفط الجيلاتين من الطبق والطبق MEFs بكثافة حوالي 50،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في DMEM مع 10 في المائة من مصل الأبقار الجنينية. بعد احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، قم بشفط الوسط وغسل لوحة MEF المحضرة باستخدام 1X PBS.

تابع إضافة 10 ملليلتر من وسط hESC المحضر مسبقا والذي يحتوي على خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات واختصارها باسم hPSCs ، إلى طبق 10 سم. بعد زرع الخلايا بكثافة 5 ملايين خلية لكل طبق ، احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية في خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. استمر في إطعام الخلايا يوميا ب 10 ملليلتر من وسط hESC الطازج.

قبل البدء في التمايز ، افحص اللوحة بحثا عن أي مستعمرات يبدو أنها تحتوي على خلايا متمايزة أو حدود غير منتظمة أو مراكز شفافة. تحت مجهر تشريح في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزاحة أي مستعمرات غير منتظمة ميكانيكيا باستخدام ماصة. لإجراء الطلاء بالبروتين الجيلاتيني مثل Matrigel ، قم أولا بتقطيع البروتين وتجميده في أجزاء مليلتر واحد لتجنب دورات ذوبان الجليد المتكررة.

بعد ذلك ، قم بإذابة وتعليق كمية مجمدة بمقدار واحد من المليلتر مع 19 مل من DMEM f12. انتقل إلى طبق خمسة ملليلتر من هذا الخليط في طبق 10 سم واحتضان الأطباق لمدة ساعة واحدة في RT. بعد ذلك ، قم بشفط البروتين الجيلاتيني مباشرة قبل طلاء الخلايا واغسله باستخدام DMEM F12. نظرا لأن هذا الطبق يتم تغليفه، حدد طبقا حيث تكون hPSCs عند التقاء 80٪ تقريبا.

تابع لشفط وسيط hESC. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS. بعد إزالة PBS ، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ trypsin-EDTA إلى اللوحة.

استمر في رج الطبق بقوة أفقيا لمدة دقيقتين حتى يتم ملاحظة MEFs تحت المجهر لتبدأ في الارتفاع كخلايا مفردة. خلال هذا الوقت ، توقع أن تظل مستعمرات hPSC مرتبطة باللوحة. استمر في شفط التربسين بمجرد رفع MEFs ولكن قبل انفصال مستعمرات hPSC.

ثم ، أضف إلى اللوحة 10 مل من وسط hESC الذي يحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد مثبط ROCK. بعد ذلك ، افصل الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل فوق المستعمرات. بعد ذلك ، عد إلى الطبق مع بروتين هلامي واستنشق المحلول.

اغسل هذا الطبق باستخدام DMEM f12 لإزالة أي كتل. وفيه لوحة hPSCs بنسبة 1 إلى 2. ثم ، أضف إلى اللوحة ، وسيط hESC يحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد حتى 10 ملليلتر.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بتغذية الخلايا يوميا بوسيط مكمل مثبطات ROCK. عندما تصل hPSCs إلى 80٪ من التقاء ، تابع بدء التمايز العصبي وحدد هذه النقطة الزمنية على أنها اليوم 0.

لبدء التمايز تغذية الخلايا في اليوم 0 واليوم 1 مع 10 ملليلتر من تمايز KSR تحتوي على 100 نانومولار LDN-193189 من مثبط MP و 10 ميكرومولار SB 431542 ، مثبط للنشطاء والعقدة. استمر في اليوم 2 عن طريق استبدال الوسط بتلك التي تحتوي على نفس تركيزات BNP ومثبطات النشط والعقدة بالإضافة إلى ثلاثة CHIR99021 ميكرومولار ، ناهض Wnt. ثم ، في اليوم 3 ، قم بتغذية الخلايا بوسط تمايز KSR ، مع استكمال 10 431542 SB ميكرومولار فقط وثلاثة CHIR99021 ميكرومولار.

بعد تحضير خليط من وسط تفاضل KSR 75٪ و 25٪ وسط تمايز N2 والذي يحتوي أيضا على ثلاثة ميكرومولار من ناهض Wnt. قم بتغذية الخلايا ب 15 مل من هذا السائل في اليومين 4 و 5. بعد ذلك ، في اليومين 6 و 7 ، قم بتغذية الخلايا ب 15 مل من الوسط الذي يتكون من 50٪ وسط تمايز KSR و 50٪ وسط تمايز N2 والذي تم استكماله أيضا بثلاثة ميكرومولار CHIR99021 25 نانوجرام لكل مليلتر BMP4 و 100 نانومولار EDN3.

بعد ذلك ، في اليومين 8 و 9 ، قم بتغذية الخلايا ب 20 مل من وسط تمايز KSR بنسبة 25٪ و 75٪ وسط تمايز N2 مع استكمال نفس تركيزات العوامل المستخدمة في اليومين 6 و 7. تابع الاستمرار في التمايز العصبي في اليوم 10 عن طريق تغذية الخلايا ب 20 مل من وسط التمايز N2 الذي يحتوي على ثلاثة ميكرومولار CHIR99021 25 نانوغرام لكل مليلتر BMP4 و 100 نانومولار EDN3. في اليوم 11 ، استنشق المحلول من الأطباق المغلفة مسبقا ب PO lamanin 1 ، و fibronectin.

ثم اترك الألواح مكشوفة في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 10 إلى 15 دقيقة تقريبا ، مما يسمح لها بالجفاف تماما. استمر في إزالة الوسيط من خلايا اليوم 11 وغسلها باستخدام PBS. ثم أضف أربعة ملليلتر من محلول انفصال الخلايا إلى الطبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.

بعد الحضانة ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الخلايا الصباغية الكاملة إلى الطبق. وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات يدويا لأعلى ولأسفل حتى ترفع عن اللوحة. انقل المعلق إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الخلايا لأسفل لمدة خمس دقائق عند 200 جيجابايت ، وبعد عد الخلايا باستخدام استبعاد Triypan Blue ومقياس الدم ، أعد تعليقها في وسط الخلايا الصباغية الكامل بكثافة 2X10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.

لوحة 10 قطرات ميكرولتر من تعليق الخلية على الأطباق المجففة والمغلفة. تأكد من أن القطرات قريبة من بعضها البعض ولكنها لا تلامس ، ولها حواف محددة جيدا ولا تعمل. للسماح للخلايا بالالتصاق ، اترك القطرات تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف ببطء 10 مل من وسط الخلايا الصباغية الكاملة إلى الطبق مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المرفقة. ثم انقل الطبق إلى الحاضنة. قم بتغذية الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام بوسط الخلايا الصباغية الكامل.

وتوقع ملاحظة التصبغ في مجموعات من الخلايا بحلول نهاية الأسبوع الأول. مرة واحدة في الأسبوع ، قم بتمرير الخلايا عن طريق ربطها أولا بمحلول انفصال الخلية كما هو موضح سابقا. بعد الجمع والطرد المركزي ، تغسل الخلايا مرتين بوسط عصبي قاعدي عادي.

بعد ذلك ، أعد طلاء الخلايا بنسبة واحد إلى ستة في وسط الخلايا الصباغية الكاملة على أطباق مغطاة بالفموي واللامانين 1 والفيبرونكتين. حوالي 30 يوما من التمايز ، ستظهر الخلايا مصطبغة بعمق. والتي يمكن تصورها بسهولة عند طلاءها بكثافة عالية أو تكويرها عند المرور.

تظهر هنا صورة ميدانية ساطعة لخلايا من خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية psox10 GFP المعدلة وراثيا المزروعة حتى اليوم 11 من بروتوكول التمايز الموصوف قبل إعادة طلاء الخلايا. يتضح في هذه الثقافات حواف داكنة محددة من الخلايا. عندما تم تقييم هذه الثقافات لإشارة GFP ، تم إثراء النتوءات الداكنة للخلايا الإيجابية sox10.

نظرا لأن sox10 هو عامل نسخ يتم تنظيمه بواسطة الخلايا الجذعية العصبية ويتم الحفاظ عليه في الخلايا الصباغية ، فإن هذه النتائج تشير إلى أنه بحلول اليوم 11 ، تم إثراء طريقة التمايز هذه للخلايا التي ستؤدي في النهاية إلى ظهور الخلايا الصباغية. كدليل على ذلك ، بحلول اليوم 20 من البروتوكول ، احتوت الثقافات الصباغية المصطبغة غير المصطبغة والناضجة والناضجة تماما. في اليوم 25 ، لوحظت نفس أنواع الخلايا في الثقافات.

يتم تأكيد وجود الخلايا الصباغية الناضجة والمصطبغة في هذه المستحضرات من خلال تلطيخها ببروتينين لإنتاج الميلانين. TYRP2 ، والذي يعمل كعلامة على كل من الخلايا الصباغية والخلايا الصباغية و TYRP1 وهي علامة الخلايا الصباغية في المرحلة المتأخرة يتم التعبير عنها هنا فقط في الخلايا الصباغية المصطبغة. بمجرد إتقانه ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا ميلانينية ناضجة مصطبغة بالكامل في 25 يوما.

البروتوكول من خلال تطور الخلايا الصباغية الطبيعي من خلال المضي قدما أولا من خلال حالة القمة العصبية وكذلك مرحلة الأرومة الصباغية.