مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم بصريا في وظيفة البروتين العصبي باستخدام حمض أميني غير طبيعي مشفر وراثيا في الخلايا العصبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول مساهمة بروتين عصبي معين في الإشارات العصبية في وظائف المخ مع الدقة الزمانية المكانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن تطبيقها على البروتينات العصبية المختلفة لتحقيق التنظيم البصري للعمليات العصبية المختلفة.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق طلاء الخلايا العصبية في الحصين على زلات الغطاء في صفيحة من 24 بئرا مع 500 ميكرولتر من وسائط النمو ، بعد الترشيح من خلال شبكة نايلون 40 ميكرومتر. بعد ذلك ، احتضن الثقافة العصبية عند 35 درجة مئوية في حاضنة من ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة بالمائة ، و 95 في المائة من الحاضنة المرطبة بالهواء لمدة 2 إلى 3 أسابيع. في يوم التعدي ، اصنع محلول كلوريد الكالسيوم الطازج 2.5 مولار في الماء المقطر المزدوج ، وقم بتصفيته معقمة بفلتر 0.22 ميكرومتر.

بعد ذلك ، اصنع 2X BBS طازجا عند درجة الحموضة 7 ، وقم بتصفيته معقمة بفلتر 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، استبدل وسائط نمو الثقافة ب 500 ميكرولتر من وسائط التعداء الطازجة الدافئة مسبقا ، ولا تتخلص من وسائط النمو القديمة. قم بإعداد محلول التعدي مباشرة قبل إضافته إلى المزرعة عن طريق الجمع بين كلوريد الكالسيوم والماء المقطر المزدوج ، مع تحريك الأنبوب ببطء.

استمر في تحريك الأنبوب وأضف الحمض النووي ببطء إلى المحلول. بعد ذلك ، أضف 2X BBS buffer Droply. يعد تحضير المخزن المؤقت 2X BBS خطوة حاسمة في تعداء فوسفات الكالسيوم ، ومن الجيد معايرة الأس الهيدروجيني الأمثل للمخزن المؤقت 2X BBS بين 6.90 إلى 7.15 لتركيبات الحمض النووي الجديدة أو الإعدادات.

بعد ذلك ، أضف على الفور 30 ميكرولترا من محلول التعدي إلى كل زلة غطاء للثقافة العصبية. هز طبق الثقافة عدة مرات لخلط المحلول ، واحتضانه عند 35 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد حوالي ساعة ، يجب ملاحظة طبقة من رواسب فوسفات الكالسيوم الدقيقة تغطي الخلايا العصبية.

بعد ذلك ، استبدل وسائط النقل ب 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الدافئ مسبقا ، واحتضنه عند 35 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. يجب أن تختفي رواسب فوسفات الكالسيوم بعد الغسيل. الآن ، استبدل مخزن الغسيل المؤقت ب 500 ميكرولتر من وسائط النمو الطازجة.

بعد ذلك ، استبدل وسائط النمو بالوسائط الأصلية المحفوظة. بعد ذلك ، أضف الأحماض الأمينية غير الطبيعية المخلوطة مسبقا Cmn في 50 ميكرولترا من وسائط النمو الدافئة إلى المزرعة ، مما ينتج عنه تركيز نهائي واحد ملليمول. احتضان الثقافة المنقولة عند 35 درجة مئوية لمدة 12 إلى 48 ساعة قبل التسجيل.

في هذا الإجراء ، قم بإعداد المحاليل خارج وداخل الخلايا. في إعدادنا ، يتم تثبيت مصباح LED بانبعاث 385 نانومتر بجوار المجهر لتوصيل الضوء إلى سنتيمتر واحد بعيدا عن النقطة المحورية بزاوية 45 درجة. بعد ذلك، اسحب بعض الماصات اللاصقة باستخدام قطب زجاجي باستخدام مجتذب ماصة صغيرة.

بعد ذلك ، خذ غطاء مزارع الخلايا العصبية من الحاضنة واشطفه مرة واحدة في المحلول خارج الخلية. قم بغزارة الحفارة بمحلول خارج الخلية. بعد ذلك ، ضع الغطاء على منصة مجهر الفيزيولوجيا الكهربية ، باستخدام تقنيات تثبيت التصحيح القياسية.

قم بتصحيح خلية عصبية منقولة باستخدام فلورسنت M-citrine. بعد ذلك ، سجل النشاط العصبي باستخدام طريقة المشبك الحالية. أولا ، اضبط جهد الراحة إلى حوالي سالب 72 مللي فولت.

بعد ذلك ، قم بحقن تيار متدرج للحث على إطلاق مستمر لإمكانات الفعل عند خمسة إلى 15 هرتز. أثناء التسجيل ، قم بتوصيل نبضات LED مفردة إلى الخلايا العصبية ، وراقب التغيرات في إمكانات عملها. ثم أضف 0.5 مللي مولر كلوريد الباريوم إلى الحمام لاستعادة إمكانات العمل.

في وضع شريحة الدماغ الحادة ، قم بتصحيح خلية عصبية باستخدام الفلورسنت M-cherry GFP من منطقة القشرة المخية الحديثة. ثم سجل نشاط PIRK باستخدام طريقة منحدر الجهد. على وجه التحديد ، راقب التيارات الداخلية المحددة Kir2.1 عند سالب 100 مللي فولت.

بعد ذلك ، قم بتوصيل نبضات LED مفردة إلى الخلايا العصبية أثناء التسجيل ، وراقب ما إذا كانت بروتينات PIRK قد تم تنشيطها. بمجرد تنشيط PIRK ، ستزداد التيارات الداخلية عند سالب 100 مللي فولت بشكل كبير. في النهاية ، أضف 0.5 مللي مولار كلوريد الباريوم إلى الحمام ، وتحقق مما إذا كان PIRK معطلا.

تظهر هنا صور نموذجية لثقافات الخلايا العصبية الصحية في الحصين للفئران. واثنين من الخلايا العصبية السليمة تظهر أجسام الخلايا الممتلئة والتشعبات والمحاور الواضحة. هذه هي صور DIC والفلورة لثقافات الخلايا العصبية في الحصين في المختبر ، ويتم نقلها للتعبير عن PIRK بدون CMN.

في وجود CMN مليمولار واحد ، تكون الخلايا العصبية المنقولة قادرة على التعبير عن بروتينات PIRK M-citrine كاملة الطول ، وبالتالي تظهر التألق الأخضر. وهنا مثال على نبضة ضوئية واحدة ، تثبط نشاط الخلايا العصبية الحصينية المعبر عنها PIRK. تظهر هذه الصور السريعة للخلايا العصبية القشرية الجنينية للفأر الدمج الناجح ل CMN في بروتينات GFP و Kir2.1 في الجسم الحي.

في هذا الرسم البياني ، يشار إلى التنشيط المعتمد على الضوء ل PIRK في التيارات المسجلة من الخلايا العصبية القشرية الحديثة للفأر. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج أمراض الدماغ الناجمة عن خلل في بروتينات عصبية معينة ، على سبيل المثال ، Kir2.1 المتحور في متلازمة أندرسنس ، لأن هذه التقنية تساعد في الكشف عن دوائر الدماغ التي تتأثر بعجز Kir2.1. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحكم في وظيفة البروتينات العصبية بالضوء بخصوصية عالية في الخلايا العصبية الحية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية في البروتينات في الخلايا العصبية لتحقيق التحكم في الصور على البروتينات العصبية ذات الأهمية.