فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين
April 10th, 2016
هنا ، نقدم بروتوكولات لفحص وتوصيف الإنزيمات بسرعة للنشاط المضاد للميكروبات. يستخدم مقايسة انتشار الشرائح الدقيقة ومقايسة إطلاق الصبغة ركائز بكتيرية مستهدفة لتقييم النشاط الأنزيمي النوعي والكمي.
الهدف العام من هذه التجارب هو فحص وتوصيف الإنزيمات بسرعة للنشاط المضاد للميكروبات. إن انتشار الانزلاق الدقيق ومقايسة إطلاق الصبغة لهما فائدة في الاكتشاف الوظيفي لمضادات الميكروبات الجديدة ذات النشاط اللايتي ضد أهداف محددة مثل البكتيريا المسببة للأمراض ذات الأهمية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في أنها سهلة التنفيذ ، وتوفر المرونة لتغيير المعلمات التجريبية ويمكن إجراؤها باستخدام معدات المختبرات الموجودة بشكل شائع في معظم مختبرات علم الأحياء الدقيقة.
قبل البدء في مقايسة انتشار الشرائح الدقيقة ، يجب تحديد تركيز الإنزيم المضاد للميكروبات المراد تقييمه باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للإنزيم المضاد للميكروبات ، باستخدام PBS كمخزن مؤقت للتفاعل. قم بتوزيع البروتين في أنابيب الطرد الدقيق الفردية واضبط الأحجام إلى 20 مل باستخدام PBS.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الاغاروز بنسبة 0.5٪ عن طريق إذابة 0.25 جرام من الاغاروز في 50 مل من PBS. سخني هذا المحلول حتى يغلي حتى يذوب الاغاروز تماما. حدد الماء المفقود أثناء عملية الذوبان بالوزن وأضفه مرة أخرى إلى المحلول.
لمنع نمو البكتيريا الملوثة أثناء حضانة الفحص ، أضف 15 ميكرولترا من أزيد الصوديوم بنسبة 10٪ في الماء إلى محلول الاغاروز ، واضبط درجة حرارة المحلول على 50 درجة مئوية في حمام مائي. إذا تم استخدام الخلايا القابلة للحياة كركيزة ، فقم بحذف أزيد الصوديوم من محلول الاغاروز. قم بإذابة الركيزة البكتيرية المقتولة بالحرارة على الجليد.
أعد تعليق الركيزة البكتيرية في 12 مل من محلول الاغاروز لتتناسب تقريبا مع تعكر معيار التعكر المكافئ 2.0 ماكفارلاند. قارن بين تعكر المحاليل من خلال تصور خط أسود على خلفية بيضاء من خلال المحاليل ، مع إضافة الركيزة البكتيرية إلى الاغاروز حتى يتم تحقيق التعكر التقريبي. على الفور ولكن بعناية ، قم بسحب ثلاثة ملليلتر من محلول ركيزة الاغاروز لكل شريحة صغيرة ، مع التأكد من أن المحلول لا يفيض بالشريحة الدقيقة.
بعد أن تصلب الشرائح ، استخدم حفار الفلين بقطر 4.8 ملم لكمة ثلاثة آبار في طبقة الركيزة الاغاروز لكل شريحة صغيرة. أضف 20 ميكرولترا من كل تخفيف تسلسلي للبروتين المعدل إلى الآبار المعنية. استخدم ألبومين مصل الأبقار في بئر تحكم سلبي.
كعنصر تحكم إيجابي ، استخدم إنزيمات المحللة للجراثيم المعروفة المناسبة للركيزة مثل الليزوزيم. احتضان الشرائح في غرفة رطوبة عند 37 درجة مئوية ، أو درجة حرارة النشاط المثلى للإنزيم. يعتمد طول الحضانة على تركيز الإنزيم المضاد للميكروبات ونشاطه المحدد.
وقت رد الفعل النموذجي هو حوالي 16 ساعة. عند اكتمال الحضانة ، راقب الشرائح تحت الضوء غير المباشر ، والتقط صورا للمقايسة النامية. استخدم كاميرا رقمية انعكاسية أحادية العدسة بعدسة 60 ملم على مسافة بؤرية تبلغ حوالي 30 سم.
في مقايسة إطلاق الصبغة التي سيتم إظهارها في الجزء التالي ، ترتبط الركيزة تساهميا بصبغة Remazol Brilliant Blue R أو RBB. ابدأ هذا البروتوكول بعمل محلول 200 مللي مولار RBB. قم بإذابة 1.25 جرام من المبارين الحمراء في محلول هيدروكسيد الصوديوم الطازج.
بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا البكتيرية المقتولة بالحرارة بتركيز 0.5 جرام من الوزن الرطب في 30 مل من محلول RBB. بالنسبة للببتيدوغليكان المنقى ، أعد تعليق الببتيدوغليكان بتركيز 0.3 جرام من الوزن الرطب في 30 مل من محلول RBB. نظرا لأن الخطوات اللاحقة هي نفسها ، بغض النظر عن الركيزة المستخدمة ، عرض الملصقات للخلايا البكتيرية فقط.
احتضان خليط التفاعل على منصة دوارة لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية مع خلط لطيف. بعد ست ساعات ، انقل خليط التفاعل إلى حاضنة أربع درجات مئوية واحتضنه لمدة 12 ساعة إضافية مع الخلط اللطيف. عند اكتمال الحضانة ، قم بحصاد الركيزة المصبوغة عن طريق الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 30 دقيقة.
صب محلول الصبغة من بيليه الركيزة. أعد تعليق الحبيبات جيدا في الماء من النوع الأول متبوعا بالطرد المركزي. سقي الخلايا المصنفة بالصبغة ثلاث إلى خمس مرات بهذه الطريقة لإزالة الصبغة القابلة للذوبان غير التساهمية من الركائز.
للغسيل النهائي ، انقل جزء الحبيبات الذي سيتم استخدامه في مقايسة إطلاق الصبغة إلى أنابيب ميكروفيوج سعة 1.5 ملليلتر. يجب أن يكون المطف في الغسيل الأخير واضحا بينما تظل الركيزة زرقاء. قم بتخزين الركيزة المصبوغة المعلقة في كمية قليلة من الماء عند 20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
للتحضير لمقايسة إطلاق الصبغة ، اسمح للركيزة المصبوغة المجمدة بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة ، واغسلها مرتين باستخدام المخزن المؤقت للفحص الذي تم تحديده تجريبيا للإنزيم. يتم استخدام PBS في هذه الحالة. احسب حجم تعليق الركيزة المطلوب بضرب حجم تفاعل 200 ميكرولتر في عدد فحوصات إطلاق الصبغة التي سيتم إجراؤها.
لتحضير تعليق الركيزة ، أضف أولا الركيزة المصبوغة إلى الحجم المناسب من PBS. قم بعمل تخفيف واحد لواحد ، وقم بإجراء قياس أولي للكثافة الضوئية عند 595 نانومتر ، باستخدام PBS كفارغ. أضف كميات متزايدة من الركيزة المصبوغة إلى التعليق حتى يتم تحقيق كثافة بصرية تبلغ 2.0 عند 595 نانومتر.
في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام مقايسة إطلاق الصبغة لتحديد ظروف الحضانة المثلى لبروتين مضاد للميكروبات. أولا ، قم بإعداد معلق مضاد للميكروبات لبروتين المخزون عن طريق ضبط التركيز إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر باستخدام PBS كما هو موضح في نص البروتوكول. ثم قم بتخفيف معلق البروتين المضاد للميكروبات إلى تركيز 100 نانوجرام لكل ميكرولتر.
يعطي هذا التركيز كتلة تفاعل نهائية تبلغ ميكروغراما واحدا من البروتين لكل حجم مضافا إلى تفاعل الفحص. قم بإجراء فحوصات التفاعل في أنابيب الطرد الدقيق سعة 0.5 ملليلتر لتقييم النطاق الحراري. لكل حالة حرارية ، أضف 10 ميكرولتر من بروتين المخزون إلى 200 ميكرولتر من تعليق الركيزة المحضر.
احتضن في جهاز تدوير حراري لمدة ثماني ساعات مع الخلط عن طريق الانعكاس مرة واحدة في الساعة. بعد الحضانة ، أوقف التفاعلات عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من الإيثانول إلى كل أنبوب ميكروفوج. لإزالة الركيزة غير القابلة للذوبان غير المهضومة ، جهاز الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة دقيقتين.
بعد ذلك ، مع الحرص على عدم تعطيل حبيبات الركيزة غير المهضومة ، انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية للتفاعل لكل خليط تفاعل إلى صفيحة دقيقة مسطحة القاع ذات 96 بئرا. لتحديد النشاط الأنزيمي ، استخدم مقياس الطيف الضوئي الدقيق لقياس امتصاص المادة الطافية عند 595 نانومتر. زيادة الامتصاص بواسطة الصبغة القابلة للذوبان المنبعثة في المادة الطافية من الركيزة المسماة هي قياس كمي للنشاط الأنزيمي.
تم استخدام مقايسة انتشار الشرائح الدقيقة لتقييم نشاط بروتين غير معروف مضاد للميكروبات ضد ركيزة الخلية الكاملة للسالمونيلا المعوية المقتولة بالحرارة. تمت إضافة مضادات الميكروبات بكميات متزايدة من الآبار من A إلى F ، وتم استخدام PBS للضوابط السلبية. بعد ست ساعات ، لوحظ حجم المنطقة الصافية للتحلل المائي التي تشكلت حول كل بئر.
يرتبط النشاط الأنزيمي العالي نوعيا بمنطقة أكبر بينما يرتبط النشاط الأنزيمي المنخفض نوعيا بمنطقة أصغر. تم استخدام مقايسة إطلاق الصبغة الكمية لتحديد درجة حرارة التفاعل المثلى لبروتين مضاد للميكروبات. كما يتضح من كميات اللون الأزرق في المواد الطافية للتفاعل ، ووحدات النشاط المشتقة من قياسات الامتصاص عند 595 نانومتر ، فإن 35 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى.
تم استخدام مقايسة إطلاق الصبغة أيضا لتحديد نطاق نشاط بروتين مضاد للميكروبات غير معروف ضد الركيزة المقتولة بالحرارة Bacillus subtilis. كشفت مقارنة مع نطاق نشاط ألفا كيموتريبسين أن الإنزيم المضاد للميكروبات غير المعروف لديه ما يقرب من ضعف التقارب مع الركيزة. بالإضافة إلى ذلك ، بينما يبدأ نشاط ألفا كيموتريبسين في الاستقرار حوالي 0.3 ميكروغرام ، استمر نشاط الإنزيم غير المعروف في الارتفاع عبر جميع كميات الإنزيم.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال مقايسة انتشار الانزلاق الدقيق في غضون 30 دقيقة. يمكن الانتهاء من اختبار إطلاق الصبغة في غضون ساعة واحدة. تعتمد أوقات الحضانة لكل اختبار على نشاط الإنزيم وتركيزاته.
بالتوسع في هذه الإجراءات ، يمكن تعديل طريقة إطلاق الصبغة لتحديد التأثيرات الكيميائية التي تؤثر على النشاط الأنزيمي للإنزيم المضاد للميكروبات عن طريق التلاعب بجوانب التفاعل مثل درجة الحموضة العازلة والملوحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص وتوصيف الإنزيمات بسرعة للنشاط المضاد للميكروبات باستخدام فحوصات انتشار الشرائح الدقيقة وإطلاق الصبغة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولات للفحص السريع وتوصيف الإنزيمات لنشاطها المضاد للميكروبات باستخدام انتشار الشرائح المجهرية وتجارب إطلاق الصبغة. تسمح هذه الطرق بتقييم نوعي وكمي للنشاط الأنزيمي ضد أهداف بكترية محددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- علم الإنزيمات
- البحث المضاد للميكروبات
الخلفية
- مقاومة المضادات الحيوية هي مصدر قلق متزايد في الرعاية الصحية.
- تعتبر طرق الفحص السريع ضرورية لاكتشاف عوامل مضادة للميكروبات جديدة.
- يمكن أن توفر التجارب الأنزيمية رؤى حول النشاط الليزالي للمضادات الحيوية المحتملة.
- يمكن استخدام معدات المختبرات الشائعة لهذه التجارب.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكولات لفحص الإنزيمات ذات الخصائص المضادة للميكروبات.
- لتقييم فعالية هذه الإنزيمات ضد بكتيريا ممرضة معينة.
- لتوفير منهجية مرنة ومباشرة للباحثين.
الطرق المستخدمة
- تجربة انتشار الشرائح المجهرية لتقييم نوعي.
- تجربة إطلاق الصبغة لقياس كمي للنشاط الأنزيمي.
- إعداد الركيزة البكتيرية وتخفيفات الإنزيم.
- استخدام الضوابط للتحقق من نتائج التجربة.
النتائج الرئيسية
- توصيف ناجح لنشاط الإنزيم ضد البكتيريا المستهدفة.
- تبيان فعالية تجربة إطلاق الصبغة.
- تأسيس الظروف المثلى لنشاط الإنزيم.
- توثيق مرئي لنتائج التجربة من خلال التصوير.
الاستنتاجات
- البروتوكولات المطورة فعالة لفحص الإنزيمات المضادة للميكروبات.
- يمكن تكييف هذه الطرق لمختلف إعدادات المختبرات.
- يمكن للبحث الإضافي البناء على هذه النتائج لاكتشاف مضادات ميكروبات جديدة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid screening of microbial libraries for novel antimicrobial proteins requires complementary qualitative and quantitative assays to efficiently prioritize targets for downstream development. The microslide diffusion assay enables fast, visual detection of proteolytic activity, while the dye-release assay provides reproducible, quantitative data to assess environmental influences on enzyme function. Together, these methods support early target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables qualitative assessment of antimicrobial enzyme activity against diverse bacterial substrates to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Supports rapid screening of large microbial libraries using minimal reagent volumes and standard microbiology equipment.
- Predictive Value: Provides initial activity readouts that help triage candidates before investing in resource-intensive characterization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The dye-release assay generates quantitative, absorbance-based measurements that enable comparison of enzymatic activity across conditions.
- Operational Value: Uses covalently labeled substrates (e.g., Remazol brilliant blue R) to increase sensitivity and reduce variability in activity readouts.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening of enzyme variants or environmental modifiers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Characterizes enzyme activity against clinically relevant pathogens (e.g., Salmonella enterica, Bacillus subtilis) to align with disease models.
- Mechanistic De-risking: Determines optimal reaction conditions (e.g., temperature, pH, salinity) to predict in vivo performance and formulation stability.
- Activity Profiling: Enables comparison of unknown antimicrobials to benchmark enzymes (e.g., alpha-chymotrypsin) to assess relative affinity and activity range.
Pipeline & Workflow Integration
The microslide diffusion and dye-release assays function as complementary early-stage tools in the antimicrobial discovery continuum, supporting progression from initial hit identification to lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by rapidly evaluating lytic activity against target pathogens to clarify mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative output generation for hit-to-lead progression.
- Analytics: Provides absorbance-based readouts at 595 nm that allow teams to quantify and compare enzymatic activity under varying conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by defining optimal enzymatic conditions that inform formulation and delivery strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening antimicrobial enzymes across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by delivering both qualitative activity zones and quantitative kinetic data.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized substrate labeling (RBB dye) and controlled incubation parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of enzyme affinity, activity range, and environmental robustness.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on characterized activity profiles and optimal conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques, including substrate preparation, turbidity standardization, and aseptic handling.
- Depends on standard laboratory equipment such as incubators, centrifuges, microplate spectrophotometers, and thermal cyclers.
- Necessitates cross-team standardization of substrate labeling protocols (e.g., RBB conjugation) to ensure assay comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the dye-release assay to different substrates (e.g., purified peptidoglycan vs. whole cells).
- Includes practical limitations such as the need for optimization of incubation times based on enzyme-specific activity and concentration.
