لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في ذبابة الفاكهة اليرقات عصبي عضلي مفرق

يتم الحفاظ على مورفولوجيا وحجم وموقع العضيات داخل الخلايا تطوريا ويبدو أنها تؤثر بشكل مباشر على وظيفتها. أصبح فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات هدفا مهما لعلم الأحياء الحديث. نوضح هنا كيف يمكن تسهيل هذه الدراسات من خلال تطبيق التقنيات الكمية.

الهدف العام لهذه المنهجية هو إظهار كيفية إجراء التحليلات الكمية للسمات التشريحية. يتم توضيح القياس الكمي للأنماط الظاهرية التي تؤثر على مورفولوجيا وحجم وموضع النوى مع العضلات المخططة ليرقات ذبابة الفاكهة. يعد فهم الآلية الجزيئية التي تتحكم في مورفولوجيا العضيات داخل الخلايا وحجمها وتوزيعها أحد أهم أسئلة علم الأحياء الحديث.

في الماضي ، كانت الاختلافات المورفولوجية بين المجموعات التجريبية وداخلها تخضع فقط للتحليل النوعي. نقترح هنا ، في التحليل الكمي الذي يجمع بين علم الوراثة ذبابة الفاكهة والتحليل الكمي المورفومتري لتحديد الجينات التي تتحكم في حجم وشكل وتوزيع النوى داخل العضلات. سيساعد في عرض الإجراء ليير ليداهاوسكي ، طالب دراسات عليا من مختبري.

بعد تشريح وتلوين الوصلات العصبية العضلية لليرقات وفقا لبروتوكول النص ، استخدم الملقط لإزالة العينات من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، ووضعها على شريحة معالجة. باستخدام مقص التشريح الدقيق ، قم بقص الرأس والذيل من الفيليه وحافظ على أسطحها الداخلية مرفوعة. الآن ، قم بإعداد شريحة تثبيت عن طريق لف ثلاثة شرائح من شريط السليلوز حول شريحة نظيفة ، على بعد سنتيمتر واحد.

ضع الغطاء على انزلاق هذه الفجوة المتوفرة حتى لا يؤدي إلى تسطيح العينات. بعد ذلك ، قم بإيداع حوالي 20 ميكرولترا من وسط التثبيت بين شرائط شريط السليلوز وانشر الوسط حولها باستخدام ملقط نظيف. الآن قم بإزالة الأنسجة الزائدة من الاستعدادات.

اسحب اليرقات المقطوعة من شريحة المعالجة إلى شريحة التثبيت وإلى وسط التثبيت ، مع الحفاظ على السطح الداخلي لأعلى. بعد ذلك ، ضع زلة غطاء برفق مع الحرص على تجنب حبس الهواء. ثم أغلق الشريحة بورنيش الأظافر الشفاف واترك الشريحة تجف لمدة 10 دقائق على الأقل قبل التصوير.

في هذا التحليل ، استخدم صورا متحدة البؤر تعرض عضلات جدار جسم اليرقات ملطخة بالأجسام المضادة DeVAP والأجسام المضادة اللامين وعلامة نووية. ثم اسحب وأفلت صور مكدس Z متحد البؤر في الساحة. انقر نقرا مزدوجا فوق الصور لفتحها تلقائيا في عرض التجاوز ، الذي يتم الوصول إليه بواسطة رمز شريط الأدوات.

عرض Surpass على ثلاث لوحات رئيسية لمساحة العمل. منطقة العرض وقائمة الكائنات ومنطقة خصائص الكائن. بعد ذلك ، انقر فوق أيقونة 3D View لإنشاء صورة ثلاثية القنوات يتم عرضها بحجم كبير.

ثم حدد إضافة نقاط قياس جديدة من شريط أدوات الكائنات واتبع معالج الإنشاء في منطقة خصائص الكائن. حدد علامة التبويب تحرير أولا ثم ، من قناة معينة ، حدد إما العلامة النووية أو قناة lamin لتمييز النوى. بعد ذلك ، اضبط المؤشر على وضع التحديد بالضغط على علامة التبويب Escape ، ثم اضبط حجم مربع المؤشر ثلاثي الأبعاد باستخدام عجلة الماوس لاحتواء نواة معينة في الصورة.

أضف نقطة قياس عن طريق الضغط على مفتاح Shift والنقر بزر الماوس الأيسر على نفس النواة. ثم أضف النقطة الثانية على نواة قريبة من نفس العضلة باستخدام نفس التقنية. سيتم رسم خط تلقائيا بين النقطتين ويتم عرض المسافة بين النواتين وتسجيلها كمتغير إحصائي.

كرر الإجراء لجميع النوى المحيطة بنواة معينة. بعد ذلك ، من بين جميع نقاط القياس التي تم جمعها ، الموجودة ضمن بيانات المسافة الإحصائية التفصيلية ، حدد أقصر مسافة. ضمن منطقة خصائص الكائن، حدد الخيار تصدير الإحصائيات مع توفر علامة التبويب عرض إلى ملف.

يؤدي ذلك إلى حفظ البيانات في جدول بيانات. في هذا التحليل ، استخدم صورا متحدة البؤر لعضلات جدار الجسم الملطخة باللون اللامين وعلامة نووية لتصور النوى. لتقييم شكل النوى العضلية ، قم بقياس كرويتها ، والتي تقارن مساحة السطح النووي بمساحة الكرة بنفس الحجم.

بدلا من ذلك ، قم بقياس الإهليلجية التي تميز البرولات أو المفلطح أو الإهليلجي والكروي. افتح الصورة كما هو موضح سابقا. ثم انقر فوق أيقونة شريط أدوات الكائنات إضافة أسطح جديدة.

في معالج الإنشاء الذي يظهر في منطقة خصائص الكائن، حدد تلطيخ العلامة النووية كقناة المصدر لعرض النوى. قم بتعيين الخيار Absolute Intensity كحد أدنى. تأكد من أن معظم النوى تظهر عرضا سلسا وغير محمل بشكل زائد عن طريق تغيير القيمة على منحنى العتبة.

في الوقت نفسه ، تجنب وجود ثقوب أو أقنعة غير مكتملة لأي نوى. بعد ذلك، استخدم أداة Filter لإزالة الضوضاء من عرض السطح. ضمن علامة التبويب تحرير للطبقة السطحية التي تم إنشاؤها حديثا، قم بتقسيم أسطح النوى التي تم عرضها بشكل غير صحيح.

خيار آخر هو دمج أسطح النوى التي يتم عرضها بشكل غير صحيح. تتوفر قيم الإهليلجية والكروية للنوى المعروضة على السطح ضمن علامة التبويب الإحصائيات. تصدير هذه البيانات للتحليل.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم صورا متحدة البؤر تبلغ عن عضلات جدار الجسم الملطخة بعلامة نووية وأجسام مضادة خاصة ب lamin و DeVAP. افتح الصورة التي تهمك من عنصر القائمة الرئيسية تحرير ثم اقتصاص 3D. اتبع معالج إنشاء Surface باستخدام قناة lamin كما هو موضح في القسم السابق.

بمجرد إنشاء السطح ، انقر فوق تحرير في منطقة خصائص الكائنات ، وحدد قناع الكل لعزل إشارة داخل النواة. بعد ذلك ، حدد إشارة DeVAP. من القائمة المنسدلة تحديد القناة ، انقر فوق الخيار تعيين Voxels Ouside the Surface واجعل هذه القيمة صفرا.

يؤدي ذلك إلى إنشاء قناة مقنعة جديدة متوفرة في نافذة ضبط الشاشة. لتصور وجود الإشارة داخل النواة ، قم بإنشاء مستوى كفاف بالنقر فوق الرمز إضافة مستوى قطع جديد من شريط أدوات الكائنات. بعد ذلك ، اضبط بشكل تفاعلي زاوية مستوى القطع وموضعه لتصور توزيع الإشارة داخل النواة.

الطفرات الخاطئة في البروتين B المرتبط ب VAMP البشري متورطة في التسبب في مرض التصلب الجانبي الضموري. باستخدام الطريقة الموصوفة ، تمت مقارنة العضلات المخططة التي تعبر عن جين تقويم العظام للذبابة DeVAP الذي يؤوي التصلب الجانبي الضموري المسبب لطفرة V2601 مع الضوابط ، معبرة عن مستويات مماثلة من النوع البري DeVAP ، أو مستويات أعلى من DeVAP من النوع البري. تم استخدام تحليل أقرب جار لتقييم توزيع النوى على طول ألياف العضلات.

بالمقارنة مع عضلات التحكم التي تعبر عن الجين المعدل DeVAP المتحور ، أو تلك التي تعبر عن البروتين من النوع البري ، تسببت الطفرة ذات الأهمية في انخفاض كبير في متوسط أقصر مسافة بين النوى. بعد ذلك ، تم فحص كروية النوى. وجد أن الجينات المعدلة وراثيا التي قللت من تباعد النوى أدت أيضا إلى توسيع حجم النوى.

كشفت عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد وعروض الحجم للنوى أن العضلات التي تعبر عن طفرة الاهتمام تشكل مجموعات تم توطينها في النوى. يمكن أيضا توسيع هذه الطريقة لتشمل التحليل الكمي للسمات المورفولوجية المرتبطة بالعضيات الأخرى ، مثل الميتوكوندريا. ارتبطت التغييرات في الهندسة النووية وموقعها وحجمها بالشيخوخة وعدد من الاضطرابات التنكسية العصبية ، مثل مرض باركنسون ومرض التصلب الجانبي الضموري.

قد يؤدي فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء عسر التصرف إلى تحديد أهداف دوائية جديدة للتدخلات العلاجية الفعالة.