تحديد مبصرة خلية الحساسية الطيفية في نموذج الحشرات من في فيفو بين الخلايا تسجيلات

الهدف العام من طريقة التسجيل داخل الخلايا هذه هو تحديد الحساسية الطيفية للخلايا المستقبلة للضوء الفردية في عين مركبة الحشرات في الجسم الحي. يمكن أن تخبرنا هذه الطريقة ما إذا كانت الأطوال الموجية للضوء التي تكون الخلية حساسة لها تتأثر بتصفية الأصباغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من خلال معرفة الحساسيات الطيفية للمستقبلات الضوئية الفردية ، يمكننا التنبؤ بنطاق الألوان التي يمكن للحيوان رؤيتها.

للتحضير للتسجيل، قم بتشغيل مصباح الزينون قبل 45 دقيقة على الأقل من التجربة، وقم بتشغيل مجتذب الأقطاب الكهربائية الدقيقة قبل 30 دقيقة على الأقل من سحب الأقطاب الكهربائية الزجاجية. بعد ذلك ، قم بتشغيل جميع معدات التسجيل. تأكد من إغلاق الغالق افتراضيا ، بحيث لا يمر أي ضوء عبر كابل الألياف الضوئية.

بعد ذلك ، اسحب الأقطاب الكهربائية الدقيقة الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب القطب الكهربائي الدقيق. ردم الأقطاب الكهربائية بثلاثة كلوريد البوتاسيوم المولي. لتحضير العينة ، تحت المجهر ، قم بلصق فراشة فردية داخل أنبوب بلاستيكي صغير بالشمع الساخن ، بحيث يكون الرأس غير متحرك وبرز من أحد طرفي الأنبوب.

ثم قم بلصق خرطوم وهوائيات وأجنحة بالشمع. بعد ذلك ، اضغط على البطن بقطعة جافة من الشمع. حافظ على ترطيب الأنبوب عن طريق وضع منديل مبلل بداخله ، خلف بطن العينة.

تأكد من أن العينة غير متحركة تماما. بعد ذلك ، قم بتركيب الأنبوب باستخدام قطعة صغيرة من الشمع على منصة صغيرة مع مفصل كروي ومقبس متصل بقاعدة مغناطيسية. تحت مجهر تشريح ، أدخل سلكا فضيا في الرأس عبر جزء الفم ، كقطب مرجعي.

قبل التجربة ، قم بإصلاح السلك بشكل دائم على المنصة. بعد ذلك ، قم بقطع ثقب صغير في القرنية اليسرى باستخدام شفرة حلاقة ، وأغلق الفتحة بالفازلين لمنع الجفاف. بمجرد قطع القرنية ، أدخل قطب التسجيل في العين في أسرع وقت ممكن ، لأن الهيموليمف في العين سوف يتصلب بسرعة ويجعل من المستحيل إدخال قطب.

إذا أمكن ، قم بإجراء التشريح في جهاز الحفر حيث سيتم التسجيل. بعد ذلك ، قم بتوصيل السلك الأرضي لمرحلة الرأس بالقطب المرجعي على منصة العينة ، باستخدام مشابك التمساح. قم بتركيب القطب الكهربائي على حامل القطب.

بعد ذلك ، أدخل السلك الفضي في محلول كلوريد البوتاسيوم في القطب الصغير. استخدم مصدر ضوء مع مرفقات رقبة الإوزة لإضاءة العينة تحت مجسم أثناء خفض القطب الكهربائي في العين. اضبط حامل القطب بحيث يكون القطب الصغير أعلى الفتحة المقطوعة مسبقا في القرنية.

بعد ذلك ، قم بخفض القطب الصغير في العين باستخدام المعالج الدقيق ، حتى تكتمل الدائرة. بمجرد دخولك العين ، قم بتأرجح المجسم خارج قفص فاراداي. قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء الذي يضيء العينة ، واترك الحشرة في الظلام لمدة 10 إلى 20 دقيقة للتكيف مع الظلام.

تحقق من مقاومة القطب الكهربائي عن طريق تطبيق تيار نانو أمبير واحد وملاحظة التغير في الجهد. يجب أن تكون المقاومة عادة في حدود 100 و 250 ميغا أوم. بعد ذلك ، قم بتنشيط مولد النبض لتوصيل وميض من الضوء طوال مدة التجربة ، وتوجيه كابل الألياف الضوئية نحو العين.

افحص راسم الذبذبات بحثا عن تغيير الجهد مع كل وميض ضوئي. يشير التغيير السلبي في الجهد إلى أن القطب لم يدخل الخلية بعد. حرك كابل الألياف الضوئية حول العينة حتى يتم ملاحظة استجابة الجهد القصوى.

لتوليد استجابة ضوئية مزيلة للاستقطاب ، قم بتدوير المعالج الدقيق ذهابا وإيابا ، مما يؤدي إلى حركات رأسية صغيرة للقطب ، مع النقر برفق على قاعدة حامل القطب الكهربائي أو استخدام وظيفة الطنين على مكبر الصوت. استمر في إجراء تعديلات صغيرة حتى تظهر استجابة ضوئية مزيلة للاستقطاب على راسم الذبذبات. بعد ذلك ، اضبط كابل الألياف الضوئية للعثور على أكبر إشارة إزالة الاستقطاب.

قم بإجراء تعديلات صغيرة باستخدام معالج دقيق ، واستخدم وظيفة الطنين على مكبر الصوت حسب الحاجة ، للتأكد من أن القطب الكهربائي يسجل الخلية بثبات. يجب أن يكون للتسجيل المستقر تغيير طفيف أو معدوم في إمكانات الراحة ، وضوضاء منخفضة في الخلفية ، واستجابة إزالة الاستقطاب الكبيرة باستمرار. من الضروري أن يكون لديك تسجيل مستقر حيث لا تكون إمكانات غشاء الراحة صاخبة ولا تتغير بمرور الوقت.

يجب أن تكون الاستجابات كبيرة وإيجابية مع عدم فرط الاستقطاب. بمجرد استقرار الإعداد ، افتح البرنامج وأغلق مربع الحوار المسمى معرض التجارب"لفتح نافذة منبثقة بأربع قنوات. اضبط مقياس الجهد في الزاوية العلوية اليمنى من نافذة البرنامج إلى 500 مللي فولت.

ثم انقر فوق ابدأ في الزاوية اليمنى السفلية لبدء التسجيل. تصغير القناتين الثالثة والرابعة، واضبط مقياس X وY. ثم اسمح للبرنامج بالعمل طوال مدة التجربة.

لتحفيز الضوء الأبيض ، سجل ما يصل إلى 10 استجابات فردية ، مع ضبط عجلة مرشح ND على أعلى OD لا يزال يثير استجابة. ويبين هنا التغيير في الاستجابة عند 3.0 OD و 2.0 OD. بعد ذلك ، سجل نفس عدد الاستجابات من 3.5 إلى 0.0 OD ، في كل مجموعة ، من أجل توفير منحنى شدة سجل الاستجابة. قبل تسجيل استجابة الخلية لجميع الأطوال الموجية باستخدام مرشحات التداخل ، ابحث أولا عن ذروة الطول الموجي.

بدون أي مرشح ND في مسار الضوء ، ضع مرشحا لإرسال الأشعة فوق البنفسجية هناك ، وراقب سعة الاستجابة لفترة وجيزة. كرر الإجراء باستخدام مرشح إرسال أزرق ومرشح إرسال أخضر ومرشح إرسال أحمر، والذي يجب أن يعطي فكرة عن مكان استجابة الذروة. سجل تحت الطول الموجي للمرشح الذي يعطي أقصى استجابة قبل التغيير إلى مرشح تداخل آخر.

بين التسجيل باستخدام المرشحات اللاحقة ، اسمح للخلية بالاستجابة لواحد أو ومضتين من الضوء الأبيض دون أي مرشح في مسار الضوء ، للمساعدة في مراقبة ما إذا كانت استجابة الذروة تتدهور بمرور الوقت. بعد ذلك، قم بالتسجيل باستخدام عوامل تصفية التداخل الأخرى، واسمح بما يصل إلى 10 استجابات لكل عامل تصفية. هذا مثال على تغيير كبير في الجهد السالب يظهر قبل دخول الخلية مباشرة.

يظهر هنا تسجيل نظيف ، يحتوي على ضوضاء خلفية قليلة ، واستجابة كبيرة لإزالة الاستقطاب ، عادة ما لا تقل عن 40 مللي فولت. وهنا مثال على تسجيل ضعيف ، بسبب التغير المحتمل السلبي بعد الذروة الرئيسية. هذا مثال آخر على التسجيل السيئ.

تمر إمكانات الراحة بتقلبات كبيرة ، ويمكن أن تحجب الكمية الكبيرة من ضوضاء الخلفية سعة الاستجابة. هذا مثال تمثيلي للحساسية الطيفية المشتقة من تسجيل واحد. يتم تصنيف أنواع الخلايا حسب ذروة الحساسية بطول موجي مماثل ، والشكل العام لطيف الحساسية.

ثم يتم حساب متوسط نفس أنواع الخلايا ، ويتم رسم متوسط الحساسية باستخدام أشرطة الخطأ القياسية في كل طول موجي. يوضح هذا الرسم البياني الحساسيات الطيفية لثلاثة أنواع نموذجية من الخلايا الموجودة في الحشرة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ساعتين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تجارب سلوكية لتحديد ما إذا كانت جميع أنواع الخلايا المستقبلة للضوء تساهم في تمييز الألوان أم لا.