متعددة الهدف اللونية الجامع جبل في الموقع التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من WISH متعدد الأهداف اللوني هو تسهيل رسم خرائط لأنماط توزيع الرنا المرسال داخل أجنة ذبابة الفاكهة السليمة. بهذه الطريقة ، يمكن مقارنة توطين mRNA لثلاثة جينات مختلفة مباشرة داخل نفس الجنين. يمكن استخدام WISH متعدد الألوان لإنشاء خرائط التعبير الجيني في الكائنات الحية النامية بطريقة سريعة وموثوقة. يمكن أن يوفر هذا أدلة مهمة على التفاعلات التنظيمية للجينات ، أو التطور النشط والجنيني ، أو تكوين الأعضاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن أنماط تعبير الرنا المرسال للجينات المختلفة يتم تصورها بألوان مميزة ومتناقضة. بهذه الطريقة ، يمكن تمييز مواقع التعبير الفريدة والمتداخلة بدقة عالية. باستخدام الإجراءات القياسية ، قم بجمع الأجنة المطلوبة وتفكيكها وإصلاحها وتغييرها. قم بتخزينها في الميثانول في الفريزر حتى الحاجة إليها. الآن ، ابدأ بالأجنة في درجة حرارة الغرفة. ضع إدخالا في البئر الأول من صفيحة 12 بئر وأضف ملليلترين من الميثانول. انقل الكمية المطلوبة من الأجنة إلى الملحق الذي يستخدم لحمل الأجنة طوال العملية. الآن ، أعد ترطيب الأجنة باستخدام حضانات لمدة ثلاث دقائق في سلسلة متناقصة من الميثانول. ابدأ ب 75٪ ميثانول في PBS. اتبع مع 50٪ ميثانول في PBS-T. بعد ذلك ، استخدم 25٪ من الميثانول في PBS-T وانتهي بحضانات في PBS-T النقي. بعد ذلك ، بادئة الأجنة في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المثبت باستخدام أربع غسلات في PBS-T. أثناء خطوات الغسيل ، قم بإذابة وإعداد محاليل العمل ل Proteinase K و glycine. بعد الغسيل ، قم باختراق الأجنة في Proteinase K المحضر حديثا لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أوقف التفاعل باستخدام غسلتين لمدة دقيقة واحدة في الجلايسين الطازج. بعد ذلك ، قم بترحيل الأجنة في 4٪ بارافورمالدهيد المصنوع في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل بارافورمالدهيد بأربع غسلات في PBS-T ثلاث دقائق للقطعة. ثم انقل الأجنة إلى المخزن المؤقت قبل التهجين. يمكن تخزينها في الفريزر لحين الحاجة. ابدأ بتوزيع الأجنة في مخزن مؤقت مسبق إلى أنبوبين مليلتر. Aliquot حوالي 15 ميكرولترا من الأجنة المستقرة في كل أنبوب. الآن ، احتضان الأجنة في 65