تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن

الهدف العام من هذه التجربة هو تطوير طريقة LAMP بسيطة باستخدام كواشف مجففة بالتجميد للكشف عن بكتيريا C.burnetii في عينات المرضى. وتكمن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في عدم الحاجة إلى التبريد لتخزين الكواشف. وتعد هذه الطريقة مثالية للاستخدام في البيئات محدودة الموارد حيث يتوطن مرض حمى Q.

ستقوم تاتيانا، وهي فنية من مختبرنا، باستعراض هذا الإجراء. ابدأ باستخدام الحمض النووي DNA للجين المستهدف IS1111a من سلالة C.burnetii RSA493، ثم حدد تركيز البلازميد باستخدام جهاز spectrophotometer عند 260 nanometers. قم بتحويل تركيز DNA البلازميد إلى عدد النسخ باستخدام الحسابات التالية، حيث يمثل الرقم 6330 طول البلازميد بـ base pairs، ويمثل 34.2 nanograms per microliter تركيز البلازميد الذي تم تحديده للتو باستخدام جهاز spectrophotometer.

بعد ذلك، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية للبلازميد بمعدل 8 إلى 10 أضعاف للوصول إلى عدد النسخ التالي لكل ميكرولتر. ولتحضير قالب DNA لتفاعل LAMP، ابدأ بـ 200 microliters من عينات البلازما البشرية، واستخلص الـ DNA باستخدام طقم DNA miniprep وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم خفف العينة النهائية إلى حجم 20 microliter.

قم بتحضير 1 mililiter من محلول منظم تفاعل LAMP بتركيز 2x عن طريق دمج الكواشف التالية. اخلط المكونات باستخدام جهاز الـ vortex بنظام النبضات لمدة 10 ثوانٍ. ولإجراء تفاعل LAMP القياسي، اخلط في أنبوب PCR سعة 0.2 milliliter كلاً من 12.5 microliters من محلول LAMP المنظم بتركيز 2x، و1.2 microliters من خليط البادئات، و1 microliter من إنزيم Bst DNA polymerase، و5.3 microliters من الماء.

بعد ذلك، أضف 5 µL من DNA إلى التفاعل الذي يبلغ حجمه 20 µL واخلطه جيداً، ثم قم بالتحضين عند 60 °C في حمام مائي أو كتلة تسخين لمدة 60 دقيقة. بعد التحضين، أوقف التفاعل بإضافة 5 µL من 10x gel loading buffer إلى الأنبوب. ثم قم بتحميل 5 µL من نواتج التفاعل على هلام أغاروز بتركيز 2% مصبوغ بصبغة الأحماض النووية المتداخلة.

قم بتشغيل الهلام في محلول TBE بتركيز 1x عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة، ثم استخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV light) لتصور النتائج. لإجراء تفاعل LAMP باستخدام كواشف مُعاد تشكيلها، قم بتحضير 1 milliliter من منظم إعادة التشكيل عن طريق دمج الكواشف التالية. اخلط المزيج باستخدام جهاز vortex بشكل نبضي لمدة 10 ثوانٍ.

بعد ذلك، أخرج الأنابيب التي تحتوي على الكواشف المجففة بالتجميد من كيس رقائق الألومنيوم المختوم. بالنسبة للخطوة 4.2، من المهم جداً التأكد من أن كيس رقائق الألومنيوم مختوم بشكل صحيح قبل فتحه. لا تستخدم الأنابيب إذا كان كيس الألومنيوم غير مختوم أو تالفاً.

أضف 20 µL من محلول إعادة التكوين (reconstitution buffer) إلى كل أنبوب من الكواشف واخلط عن طريق السحب والطرد بالمصّة خمس مرات. تأكد من إعادة تعليق الكواشف المجففة بالتجميد بشكل كامل. بعد ذلك، أضف 5 µL من قالب DNA إلى الكواشف التي تمت إعادة تكوينها واخلط جيداً.

يتم التحضين عند 60 degrees Celsius في حمام مائي أو كتلة تسخين لمدة 60 minutes. ولإيقاف التفاعل بعد التحضين، يتم إضافة 5 µL من 10x gel loading buffer، ثم تُضاف 5 µL من نواتج التفاعل إلى agarose gel بتركيز 2% مصبوغ بصبغة حمض نووي متداخلة. يتم تشغيل الهلام في 1x TBE buffer عند 100 volts لمدة 35 minutes، ثم تُفحص النتائج باستخدام UV light.

لإجراء تفاعل LAMP باستخدام هيدروكسي نافثول الأزرق (hydroxynaphthol blue)، أو HNB، أو صبغة تداخلية، قم بتحضير 1 milliliter من محلول إعادة التكوين (reconstitution buffer) عن طريق دمج الكواشف التالية التي تتضمن HNB أو صبغة تداخلية فلورية. اخلط المكونات باستخدام جهاز vortex بنبضات لمدة 10 seconds. قم بإجراء تفاعل LAMP كما هو موضح سابقاً، واستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV light) أو العين المجردة لمعاينة النتائج.

لإجراء تفاعل LAMP باستخدام ماسح الأنابيب، أضف 5 µL من DNA إلى الكواشف المعاد تشكيلها التي تحتوي على صبغة تداخل فلورية، ثم أدخل الأنبوب المغلق في ماسح الأنابيب. اضبط درجة حرارة التحضين على 60 °C وقم بقياس الفلورية عند 520 nm لمدة 60 دقيقة. يوضح هذا الشكل نتائج تفاعل LAMP على هلامات الأجاروز باستخدام كواشف محضرة حديثاً وكواشف مجففة بالتجميد.

يُلاحظ أن الكاشف المجفف بالتجميد يحافظ على نشاطه. وقد كشفت تفاعلات LAMP التي تم تحضيرها باستخدام كلا الكاشفين عن 25 نسخة من قالب DNA. يوضح هذا الشكل الكشف عن نواتج التفاعل باستخدام HNB أو صبغة تداخل فلورية في التفاعل.

تؤدي إضافة HNB إلى التفاعل إلى حدوث تغير بصري في اللون، من الأرجواني إلى الأزرق، عند وجود 25 و 50 و 100 نسخة من قالب DNA في التفاعلات. بالإضافة إلى ذلك، يظهر إدراج صبغة تداخل فلورية في التفاعل إشارة فلورية قوية عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية UV في حالة وجود أعداد مماثلة من نسخ DNA. تظهر هنا النتائج الناتجة عن استخدام ماسح الأنابيب لمراقبة الإشارات الفلورية في الوقت الفعلي باستخدام صبغة تداخل فلورية.

تكون الإشارات الفلورية أعلى من خط الأساس بعد 14 و18 و21 و23 دقيقة، مع وجود 10^6 و10^4 و10^3 و100 نسخة من قالب DNA في التفاعلات. وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إتمامه في غضون 90 دقيقة. وبعد تطويره، مهد هذا المقايسة الطريق للتشخيص السريع لعدوى Coxiella burnetii في المناطق ذات الموارد المحدودة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة تكوين كواشف LAMP المجففة بالتجميد. لا تنسَ أن عينات المرضى قد تكون معدية، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات الوقائية دائماً أثناء تنفيذ هذا الإجراء.