تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن الكوكسيلا البورنيتية

الهدف العام من هذه التجربة هو تطوير طريقة LAMP بسيطة باستخدام الكواشف المجففة بالتجميد للكشف عن C.burnetii في عينات المرضى. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه لا يلزم تدريب لتخزين الكواشف. هذه الطريقة مثالية للاستخدام في الأماكن المحدودة الموارد حيث تكون حمى Q مستوطنة.

ستظهر الإجراء تاتيانا ، فنية من مختبرنا. بدءا من الحمض النووي للجين المستهدف IS1111a من C.burnetii RSA493 ، حدد تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر. قم بتحويل تركيز الحمض النووي البلازميد إلى رقم نسخة باستخدام الحسابات التالية ، حيث يساوي 6330 طول وأزواج القاعدة للبلازميد ، و 34.2 نانوجرام لكل ميكرولتر هو تركيز البلازميد ، كما هو محدد للتو باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

ثم قم بإعداد تخفيفات تسلسلية من 8 إلى 10 أضعاف من البلازميد للوصول إلى العدد التالي من النسخ لكل ميكرولتر. لتحضير قالب الحمض النووي لتفاعل LAMP ، ابدأ ب 200 ميكرولتر من عينات البلازما البشرية ، وباستخدام مجموعة أدوات التحضير المصغر للحمض النووي ، استخرج الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. خفف العينة النهائية إلى حجم 20 ميكرولتر.

قم بإعداد 1 ملليلتر من 2x LAMP LAMP المؤقت عن طريق الجمع بين الكواشف التالية. تخلط عن طريق الدوران النبضي لمدة 10 ثوان. لإجراء تفاعل LAMP القياسي ، في أنبوب PCR سعة 0.2 مل ، امزج 12.5 ميكرولتر من 2x LAMP المؤقت ، و 1.2 ميكرولتر من مزيج التمهيدي ، و 1 ميكرولتر من بوليميراز Bst DNA ، و 5.3 ميكرولتر من الماء.

بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولترات من الحمض النووي إلى تفاعل 20 ميكرولتر واخلطه جيدا ، ثم احتضن عند 60 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تسخين لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإنهاء التفاعل بإضافة 5 ميكرولتر من عازلة تحميل الهلام 10x إلى الأنبوب. ثم قم بتحميل 5 ميكرولترات من منتجات التفاعل على هلام الاغاروز بنسبة 2٪ ملطخ بصبغة الحمض النووي المتداخلة.

قم بتشغيل الجل في 1x TBE عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة ، ثم استخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور النتائج. لإجراء تفاعل LAMP مع الكواشف المعاد تكوينها ، قم بإعداد 1 مليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين عن طريق الجمع بين الكواشف التالية. تخلط عن طريق الدوران النبضي لمدة 10 ثوان.

بعد ذلك ، قم بإزالة الأنابيب التي تحتوي على الكواشف المجففة بالتجميد من كيس رقائق الألومنيوم المختوم. بالنسبة للخطوة 4.2 ، من المهم جدا التأكد من إغلاق كيس رقائق الألومنيوم بشكل صحيح قبل فتحه. لا تستخدم الأنابيب إذا كان كيس الألمنيوم غير محكم الغلق أو تالف.

أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى كل أنبوب من الكواشف واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات. تأكد من إعادة تعليق الكواشف المجففة بالتجميد تماما. ثم أضف 5 ميكرولترات من قالب الحمض النووي إلى الكواشف المعاد تشكيلها واخلطها جيدا.

احتضن عند 60 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تدفئة لمدة 60 دقيقة. لإنهاء التفاعل بعد الحضانة ، أضف 5 ميكرولتر من مخزن تخزين هلام 10x ، ثم أضف 5 ميكرولتر من منتجات التفاعل إلى هلام الاغاروز 2٪ الملطخ بصبغة الحمض النووي المتداخلة. قم بتشغيل الجل في 1x TBE buffer عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة ، ثم تصور النتائج بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

لإجراء تفاعل LAMP مع هيدروكسي نافثول الأزرق ، أو HNB ، أو صبغة متداخلة ، قم بإعداد 1 مليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين عن طريق الجمع بين الكواشف التالية التي تشمل HNB أو صبغة إقحام الفلورسنت. تخلط عن طريق الدوران النبضي لمدة 10 ثوان. قم بإجراء تفاعل LAMP كما هو موضح للتو واستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو العين المجردة لتصور النتائج.

لإجراء تفاعل LAMP باستخدام ماسح ضوئي أنبوبي ، أضف 5 ميكرولترات من الحمض النووي إلى الكواشف المعاد تكوينها التي تحتوي على صبغة الفلورسنت المتداخلة ، ثم أدخل الأنبوب المغلق في الماسح الضوئي الأنبوبي. اضبط درجة حرارة الحضانة على 60 درجة مئوية وقم بقياس التألق عند 520 نانومتر لمدة 60 دقيقة. يوضح هذا الشكل نتائج تفاعل LAMP على المواد الهلامية الاغاروز مع الكواشف المعدة حديثا والكواشف المجففة بالتجميد.

لاحظ أن الكاشف المجفف بالتجميد يحافظ على نشاطه. اكتشفت تفاعلات LAMP التي أعدها كلا الكواشف 25 نسخة من قالب الحمض النووي. في هذا الشكل ، يظهر اكتشاف نواتج التفاعل باستخدام HNB أو صبغة إقحام الفلورسنت في التفاعل.

تؤدي إضافة HNB إلى التفاعل إلى تغيير اللون البصري ، من الأرجواني إلى الأزرق ، مع وجود 25 و 50 و 100 نسخة من قالب الحمض النووي في التفاعلات. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر إدراج صبغة إقحام الفلورسنت في التفاعل إشارة فلورية قوية مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند وجود أرقام نسخ DNA مماثلة. فيما يلي نتائج استخدام الماسح الضوئي الأنبوبي لمراقبة إشارات الفلورسنت في الوقت الفعلي باستخدام صبغة الفلورسنت المتداخلة.

تكون إشارات الفلورسنت أعلى من خط الأساس بعد 14 و 18 و 21 و 23 دقيقة ، مع 10 ^ 6 و 10 ^ 4 و 10 ^ 3 و 100 نسخة من قالب الحمض النووي في التفاعلات. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذا الإجراء في 90 دقيقة. بعد تطويره ، مهد هذا الاختبار الطريق للتشخيص السريع لعدوى Coxiella burnetii في المناطق المحدودة الموارد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة تكوين كواشف LAMP المجففة. لا تنس أن عينات المرضى يمكن أن تكون معدية ويجب دائما اتخاذ احتياطات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.