التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تضخيم مواقع تكامل الفيروسات القهقرية من الحمض النووي الجيني السائب ، وتسلسل مكتبة الحمض النووي الناتجة ، بحيث يمكن تعيين مواقع التكامل الدقيقة إلى الجينوم المرجعي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الفيروسات القهقرية الأساسي والسريري من خلال تحليل توزيع مواقع التكامل في جميع أنحاء الجينوم المضيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عمق تسلسل الحمض النووي ، وحقيقة أن العديد من العينات قد يتم تعدد الإرسال في تشغيل تسلسل واحد.

قبل يوم واحد من التعدي ، لوحة 3.3 في 10 إلى الخلايا HEK293T السادسة في 10 ملليلتر من Dulbecco's Modified Eagle's Medium في كل من خمسة أطباق 100 ملم. في اليوم التالي ، استخدم كواشف التعداء المتوفرة تجاريا أو فوسفات الكالسيوم لنقل الخلايا ب 10 ميكروغرامات من البلازميد التي تحمل استنساخا جزيئيا كامل الطول للفيروسات القهقرية أو تسعة ميكروغرامات من نواقل الجولة المفردة المغلفة بالإضافة إلى ميكروغرام واحد من بنية تعبير VSV-G. أضف الخليط إلى وسائط الخلية بالتنقيط.

بعد التعدي ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد حوالي 48 ساعة ، قم بحصاد الوسائط الخلوية المحتوية على الفيروس باستخدام ماصة حجمية ، وقم بتمريرها عبر مرشح 0.45 ميكرون عن طريق تدفق الجاذبية. بعد ذلك ، قم بتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 200 ، 000 جي ثانية لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية حتى يتبقى حوالي 500 ميكرولتر من DMEM FPS ، وأعد تعليق حبيبات الفيروس. أضف 20 وحدة من DNase واحتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. حدد تركيز p24 باستخدام مجموعة التقاط مستضد فيروس نقص المناعة البشرية 1 p24 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

في اليوم السابق للإصابة ، قم بوضع 3.0 مرات 10 إلى الخلايا HEK293T الخامسة في 2.5 مل من DMEM FPS لكل بئر في صفيحة من ستة آبار واحتضانها طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة. إصابة الخلايا بتركيز p24 فيروسي نهائي يبلغ 500 نانوجرام لكل مليلتر في 500 ميكرولتر من DMEM FPS الطازج. احتضن لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد ساعتين ، أضف ملليلترين من DMEM FPS المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية لكل بئر وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد 48 ساعة من الإصابة ، قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا بملليلترين من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات. احصد الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من Trypsin-EDTA الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، وبعد بضع ثوان ، قم بفحص الآبار بصريا بحثا عن إزاحة الخلايا.

بعد ذلك، أضف ملليلترين من DMEM FPS الدافئ مسبقا وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة حجمية. انقل المحلول إلى قارورة زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سنتيمترا مربعا تحتوي على 18 مل من DMEM FPS الدافئ مسبقا ، وأعد إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد خمسة أيام على الأقل من الإصابة ، قم بحصاد الخلايا كما كان من قبل وأعد تعليقها في خمسة ملليلتر من DMEM FPS الدافئ مسبقا عن طريق سحب العينات.

قم بالطرد المركزي للمحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 2 ، 500 جي ، ثم استنشق وتخلص من المادة الطافية. أخيرا ، استخرج الحمض النووي الجيني من حبيبات الخلية باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا. قم بتصفية الحمض النووي من عمود التبادل الأيوني المزود ب 200 ميكرولتر من المليمولار Tris-HCL عند درجة الحموضة 8.5.

بعد صوتنة الحمض النووي الجيني ، قم بتنقية الحمض النووي المونيكيد باستخدام مجموعة تنقية PCR. بعد ذلك ، قم بإصلاح الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات إصلاح نهائية. بعد تنقية الحمض النووي كما كان من قبل ، ذيل الحمض النووي باستخدام إنزيم Klenow Exo-Minus.

بدلا من ذلك ، من أجل التجزئة عن طريق تقييد هضم نوكلياز داخلي ، قم بقطع الحمض النووي الجيني بمزيج من الإنزيمات التي تولد 5'TA متدلية ، بالإضافة إلى إنزيم غير متوافق مثل BglII الذي يشق في اتجاه مجرى النهر من LTR الفيروسي المنبع. قطع 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني في حجم نهائي من 100 ميكرولتر. احتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

تأكد من تنظيف الحمض النووي النهائي باستخدام مجموعة تنقية PCR. يجب أن يحتوي الرابط الذي سيتم استخدامه مع الحمض النووي الصوتي على T 3'overdle متوافق ، بينما يجب أن يحتوي رابط الحمض النووي المهضوم MseI على 5'TA متدلي متوافق. ابدأ بتلدين 10 ميكرومولار من خيوط الربط القصيرة والطويلة في 35 ميكرولترا من المخزن المؤقت Tris-HCL EDTA عن طريق التسخين إلى 90 درجة مئوية والتبريد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة بخطوات درجة مئوية واحدة في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد ما لا يقل عن أربعة تفاعلات ربط متوازية لكل عينة من الحمض النووي الجيني تحتوي على 1.5 رابط مرتبط بالميكرومولار ، وميكروغرام واحد من الحمض النووي المجزأ ، و 800 وحدة من T4 DNA ligase في حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا. اربط بين عشية وضحاها عند 12 درجة مئوية. بالنسبة للعينات المحضرة عن طريق الصوتنة ، قم بهضم تفاعل الربط المنقى باستخدام إنزيم تقييد يشق في اتجاه مجرى النهر من LTR المنبع.

استخدم 100 وحدة من الإنزيم المناسب في ظل الظروف الموصى بها من قبل الشركات المصنعة بين عشية وضحاها. تأكد من تنقية المنتجات النهائية باستخدام مجموعة تنقية PCR. قم بإعداد الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الكواشف الموضحة هنا.

قم بتشغيل الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المعلمات التالية: 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 30 دورة 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. ننتهي ب 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتجميع تفاعلات الجولة الأولى وتنقية الحمض النووي كما كان من قبل.

ثم قم بإعداد الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على الكواشف الموضحة هنا. استخدم نفس معلمات ركوب الدراجات كما هو الحال في الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد تجميع وتنقية الحمض النووي من تفاعل الجولة الثانية ، قم بإجراء مراقبة الجودة وتسلسل الجيل التالي ، وتحليل مواقع التكامل باستخدام التعليمات التفصيلية في الجزء المكتوب من البروتوكول.

محاذاة مواقع التكامل من المكتبات التي تم إعدادها عن طريق الهضم باستخدام إنزيمات التقييد ، كما هو موضح على اليسار ، أو صوتنة ، كما هو موضح على اليمين ، باستخدام برنامج شعار الويب. يتم تصوير كل تخفيف في سلسلة المعايرة بالتحليل الحجمي، من الحمض النووي الأنيق في الجزء العلوي من الشكل، إلى الحد الأقصى للتخفيف من واحد إلى 15،625 في الأسفل. تنخفض درجة اليقين مع زيادة تخفيف الحمض النووي للخلايا المصابة.

تظهر هذه الصورة شعار التسلسل للتحكم العشوائي المتطابق ل 50،000 موقع جيني فريد. لاحظ أن المواقع العشوائية المحاذاة من مجموعة بيانات MRC ، على النقيض من ذلك ، فشلت في إنشاء مستويات ملحوظة من التفضيلات الأساسية. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير مكتبات مواقع التكامل من الحمض النووي الجيني في ثلاثة أيام.

وبالتالي يمكن إكمال رسم خرائط مواقع التكامل، من العدوى الأولية إلى المعلوماتية الحيوية المكتملة، في غضون أسبوعين تقريبا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن فهرسة الآلاف أو حتى الملايين من مواقع تكامل الفيروسات القهقرية الفريدة ، ويمكن إجراء تحليلات متنوعة لتحديد الارتباطات بين مواقع الإدراج والتعليقات التوضيحية الجينية.