التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تضخيم مواقع التكامل الفيروسي القهقري (retroviral integration sites) باستخدام تقنية PCR من الحمض النووي الجينومي الشامل، وتسلسل مكتبة الحمض النووي الناتجة، بحيث يمكن تحديد مواقع التكامل الدقيقة ومطابقتها مع جينوم مرجعي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في علم الفيروسات القهقرية الأساسي والسريري من خلال تحليل توزيع مواقع التكامل عبر جينوم المضيف. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في عمق تسلسل الحمض النووي، وحقيقة إمكانية دمج العديد من العينات في عملية تسلسل واحدة (multiplexed).

قبل يوم واحد من عملية تر transfection، يتم توزيع 3.3 × 10⁶ من خلايا HEK293T في 10 ml من وسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium المكمل في كل طبق من خمسة أطباق بقطر 100 mm. وفي اليوم التالي، تُستخدم كواشف transfection متاحة تجارياً أو فوسفات الكالسيوم لنقل 10 µg من البلازميد الذي يحمل مستنسخات جزيئية ريتروفيروسية كاملة الطول، أو 9 µg من نواقل الدورة الواحدة المغلفة والمختصرة بالإضافة إلى 1 µg من بناء تعبير VSV-G إلى الخلايا. يُضاف المزيج إلى وسط الخلايا قطرة بقطرة.

بعد عملية ترنسفكشن، تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون. وبعد مرور 48 ساعة تقريباً، يتم جمع الأوساط الخلوية المحتوية على الفيروس باستخدام ماصة حجمية، ثم يتم تمريرها عبر مرشح بمسامية 0.45 ميكرون عن طريق التدفق بالجاذبية. بعد ذلك، يُركّز الفيروس بواسطة الطرد المركزي الفائق عند 200,000 Gs لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي حتى يتبقى حوالي 500 µL من DMEM FPS، ثم أعد تعليق كتلة الفيروس. أضف 20 units من DNase واحضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. حدد تركيز p24 باستخدام طقم التقاط مستضد HIV-1 p24 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قبل يوم واحد من العدوى، يتم زرع 3.0 × 10⁵ من خلايا HEK293T في 2.5 milliliters من DMEM FPS لكل بئر في طبق سداسي الآبار، وتحضن طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة. تُعدى الخلايا بتركيز نهائي من الفيروس p24 يبلغ 500 nanograms per milliliter في 500 microliters من DMEM FPS الطازج. تُحضن لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد مرور ساعتين، أضف 2 mL من وسط DMEM FPS المسخن مسبقاً إلى 37 °C إلى كل بئر، وأعد الطبق إلى الحاضنة. وبعد 48 ساعة من الإصابة، أزل الوسط واغسل الخلايا باستخدام 2 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات. احصد الخلايا بإضافة 0.5 mL من Trypsin-EDTA المسخن مسبقاً إلى 37 °C، وبعد بضع ثوانٍ، افحص الآبار بصرياً للتأكد من انفصال الخلايا.

أضف بعد ذلك 2 mL من وسط DMEM FPS المجهز مسبقاً، وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة 10 مرات باستخدام ماصة حجمية. انقل المحلول إلى قارورة زراعة أنسجة بمساحة 75 cm² تحتوي على 18 mL من وسط DMEM FPS المجهز مسبقاً، وأعدها إلى حاضنة زراعة الأنسجة. وبعد مرور خمسة أيام على الأقل من العدوى، احصد الخلايا كما في السابق وأعد تعليقها في 5 mL من وسط DMEM FPS المجهز مسبقاً عن طريق السحب بالماصة.

قم بطرد المحلول مركزياً لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 2,500 Gs، ثم اشفط السائل الطافي وتخلص منه. وأخيراً، استخلص الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) من كتلة الخلايا المترسبة باستخدام طقم تجاري متاح. استخلص الـ DNA من عمود التبادل الأيوني المرفق باستخدام 200 µL من Tris-HCL بتركيز ملي مولار وعند pH 8.5.

بعد إجراء عملية السونكة للحمض النووي الجينومي، قم بتنقية الحمض النووي المـُسونك باستخدام طقم تنقية PCR. بعد ذلك، قم بإصلاح الحمض النووي باستخدام طقم إصلاح النهايات. وبعد تنقية الحمض النووي كما في الخطوة السابقة، قم بإضافة ذيل A إلى الحمض النووي باستخدام إنزيم Klenow Exo-Minus.

بدلاً من ذلك، ومن أجل التجزئة عن طريق الهضم بإنزيمات التقييد، يتم قطع الحمض النووي الجينومي باستخدام خليط من الإنزيمات التي تولد بروزات 5'TA، بالإضافة إلى إنزيم غير متوافق مثل BglII الذي يقوم بالقطع في اتجاه المصب من منطقة LTR الفيروسية الموجودة في اتجاه المنبع. يتم قطع 10 micrograms من الحمض النووي الجينومي في حجم نهائي قدره 100 microliters، ثم تُحضن العينات طوال الليل عند 37 degrees Celsius.

تأكد من تنقية الحمض النووي (DNA) النهائي باستخدام طقم تنقية PCR. يجب أن يحتوي الرابط (linker) المستخدم مع الحمض النووي المعالج بالسونيكة على بروز T 3' متوافق، بينما يجب أن يحتوي الرابط الخاص بالحمض النووي المهضوم بإنزيم MseI على بروز 5'TA متوافق. ابدأ بعملية التلدين (annealing) لـ 10 µM من خيوط الرابط القصيرة والطويلة في 35 µL من منظم Tris-HCL EDTA عن طريق التسخين إلى 90 °C ثم التبريد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة بمعدل درجة مئوية واحدة كل دقيقة.

بعد ذلك، قم بتحضير أربعة تفاعلات ربط متوازية على الأقل لكل عينة DNA جينومي، بحيث تحتوي كل منها على 1.5 micromolar من الرابط المربوط، وواحد microgram من DNA المُجزأ، و800 units من T4 DNA ligase في حجم نهائي قدره 50 microliters. يتم إجراء عملية الربط طوال الليل عند درجة حرارة 12 degrees Celsius. بالنسبة للعينات التي تم تحضيرها بواسطة الموجات فوق الصوتية (sonication)، قم بهضم تفاعل الربط المُنقى باستخدام إنزيم قطع يقطع في اتجاه المصب من LTR العلوي.

استخدم 100 وحدة من الإنزيم المناسب وفقاً للشروط الموصى بها من قبل الشركة المصنعة طوال الليل. تأكد من تنقية النواتج النهائية باستخدام طقم تنقية PCR. قم بتحضير جولات PCR الأولى باستخدام الكواشف الموضحة هنا.

قم بإجراء الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام المعلمات التالية: 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، تليها 30 دورة تتكون من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و68 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. انتهِ بـ 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ادمج نواتج تفاعلات الجولة الأولى وقم بتنقية الـ DNA كما سبق.

بعد ذلك، قم بتحضير تفاعلات PCR للجولة الثانية التي تحتوي على الكواشف الموضحة هنا. استخدم نفس معايير الدورات المستخدمة في تفاعل PCR للجولة الأولى. بعد تجميع وتنقية الحمض النووي DNA من تفاعل الجولة الثانية، قم بإجراء مراقبة الجودة وتسلسل الجيل التالي، وقم بتحليل مواقع التكامل باستخدام التعليمات المفصلة الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول.

تمت محاذاة مواقع التكامل من المكتبات التي تم تحضيرها عن طريق الهضم باستخدام إنزيمات التقييد، كما هو موضح على اليسار، أو عن طريق الموجات فوق الصوتية (sonication)، كما هو موضح على اليمين، باستخدام برنامج web logo. يظهر كل تخفيف في سلسلة المعايرة، بدءًا من الحمض النووي المركز (neat DNA) في أعلى الشكل، وصولاً إلى أقصى تخفيف بنسبة 1 إلى 15,625 في الأسفل. وتقل درجة اليقين مع زيادة تخفيف الحمض النووي للخلايا المصابة.

تظهر هذه الصورة شعار التسلسل (sequence logo) لمجموعة الضبط العشوائي المطابقة لـ 50,000 موقع جينومي فريد. نلاحظ أن المواقع العشوائية المحاذات من مجموعة MRC، على النقيض من ذلك، لم تولد مستويات ملحوظة من تفضيلات القواعد. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن تحضير مكتبات مواقع التكامل من الحمض النووي الجينومي في غضون ثلاثة أيام.

وبناءً على ذلك، يمكن إتمام عملية رسم خرائط مواقع التكامل، بدءاً من العدوى الأولية وصولاً إلى التحليلات المعلوماتية الحيوية المكتملة، في غضون أسبوعين تقريباً. وباتباع هذا الإجراء، يمكن فهرسة الآلاف أو حتى الملايين من مواقع التكامل الفيروسية القهقرية الفريدة، كما يمكن إجراء تحليلات متنوعة لتقدير الارتباطات بين مواقع الإدراج والتوصيفات الجينومية.