والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

الهدف العام من مصفوفة الجليكان المصغرة هذه هو تحليل خصوصية وحماس هيماجلوتينين فيروس الأنفلونزا A. يمكن أن يساعد هذا الاختبار في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بارتباط مستقبلات فيروس الأنفلونزا A والحماس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه في إطار اختبار واحد يمكننا معالجة الخصوصية بالإضافة إلى شغف الارتباط النسبي ، والذي لا يتم تحقيقه عادة ضمن مصفوفة الجليكان النموذجية والمقايسات القائمة على اللوحة.

يبدأ هذا البروتوكول بتحضير عينات الجليكان. الحل الأساسي للجليكان هو مخزن مؤقت لطباعة المخزون ، عند صنعه ، يجب معايرته ببطء إلى درجة حموضة 8.5 ثم إعطائه إضافة مادة خافضة للتوتر السطحي. باستخدام مخزن الطباعة المؤقت المحضر ، قم بتخفيف الجليكان المترافق ب PAA إلى 100 ميكروغرام لكل ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الجليكان أحادي التكافؤ إلى 100 ميكرومولار أيضا في مخزن الطباعة العازلة. أخيرا ، قم بعمل مخزون من الأصباغ الوظيفية بالأمين في ميكرومولار واحد. الآن قم بتحميل عشرة ميكرولترات من كل عينة جليكان في بئر من صفيحة ميكروتيتر 384 بئر.

هذا حل كاف لطباعة خمس شرائح. انقل أيضا عشرة ميكرولترات من علامة الصبغة إلى بئر واحد من لوحة الطباعة. استعد لطباعة المصفوفات عن طريق وضع دبابيس المصفوفة ورأس الطباعة أولا وفقا للتخطيط.

في هذه الحالة ، يمكن لدبوس واحد طباعة جميع العينات. تتم طباعة مصفوفات الجليكان في كتل من ستة محاطة ببقعة فارغة من جميع الجوانب. ارتد القفازات للتعامل مع الشرائح.

قم بفكها وتفجير أي حطام من أسطحها بغاز نيتروجين عالي النقاء. بعد ذلك ، ضع الشرائح المطلية لأعلى على مرحلة المصفوفة. ثم قم ببرمجة المصفوفة.

في هذه الحالة ، قم ببرمجة 27 نقطة لكل زيارة إلى لوحة المصدر. يتم استخدام ثلاث بقع مسبقة موضوعة على المنطقة غير المصفوفة للشريحة المطلية ب poly-L-lysine لإزالة السائل الزائد عند طرف الدبوس. يتم استخدام النقاط ال 24 الأخرى لكل زيارة دبوس لوضع ستة نقاط في أربعة مصفوفات مكررة.

وترد التفاصيل في بروتوكول النص. الآن ، قم بتحميل الألواح متعددة الآبار في الطابعة وابدأ في طباعة المصفوفات. أثناء الطباعة ، تأكد من بقاء الرطوبة بين 55 و 65٪ انتبه إلى ظهور البقع المسبقة على الشرائح المطلية ب poly-L-lysine.

بعد الطباعة ، افحص كل شريحة بصريا. تحقق من المحاذاة الصحيحة للبقع داخل حدود التفلون ، وهو أمر حيوي ، وتحقق من العدد الصحيح للميزات المرقطة. للمساعدة في تجانس مرفق النقاط ، ضع الشرائح المطبوعة في غرفة رطوبة بنسبة 100٪ مع وضع جانبها المطبوع لأعلى فور صنعها.

استخدم مناشف ورقية مبللة لبطانة الحاوية والرف المؤقت. لف الغرفة بالبلاستيك لحبس الرطوبة. بعد نصف ساعة ، قم بإزالة الشرائح.

بعد ذلك ، قم بترقيم الشرائح بعلامة مقاومة للمذيبات وقم بتخزينها في صندوق تجفيف طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإعداد مخزون جديد من العازلة الحجب مع التحريك القوي. اضبط الرقم الهيدروجيني 9.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم المركز.

ثم احتضن الشرائح في المخزن المؤقت لمدة ساعة. لإزالة الكتلة ، اشطف الشرائح بالماء المقطر المزدوج. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى حوامل تلطيخ الزجاج وقم بتحميل الحوامل في حامل لوحة متأرجحة لتدوير الشرائح الجافة عند 10 جم لمدة خمس دقائق.

بمجرد أن تجف ، إذا لزم الأمر ، قم بتخزين الشرائح عند 20 درجة مئوية تحت الصفر في أكياس بلاستيكية محكمة الغلق. في التحضير ، قم بعمل غرفة ترطيب أخرى كما كان من قبل. للكشف عن الجليكان الثابت ، قم بإعداد الليكتينات البيوتينيل SNA و ECA عند 10 ميكروغرام لكل مليلتر في مخزن مؤقت للفحص ، وأضف ميكروغرامين لكل مليلتر من الستربتافيدين 555 إلى كل تخفيف.

للتلطيخ بالهيماجلوتينين ، اصنع محلول 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد المعقد مسبقا في حجب المخزن المؤقت بنسبة مولار من أربعة إلى اثنين إلى واحد كما هو موضح في بروتوكول النص. انقل 20 ميكرولترا من المحاليل المحضرة إلى آبار من صفيحة 384 بئرا. بعد ذلك ، قم بتخفيف الليكتين والهيماجلوتينين بشكل متسلسل في المخازن المؤقتة المناسبة.

قم بعمل ثمانية تخفيفات ، واملأ كل بئر ب 10 ميكرولتر من العينة و 10 ميكرولتر من العازلة. الآن ، احتضن الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة. أضف الآن ثمانية ميكرولترات من كل تخفيف إلى واحد من 48 ميكرو بئر على شريحة مطبوعة.

ثم احتضن الشريحة المحضرة في غرفة الترطيب لمدة 90 دقيقة. بعد 90 دقيقة ، اغسل الشريحة مع الإمساك بها من الحافة ؛ اغمسها في PBS-T أربع مرات ، ثم اغمسها في PBS أربع مرات وأخيرا اغمسها في ماء منزوع الأيونات أربع مرات. الآن ، قم بتجفيف الشريحة كما كان من قبل.

بعد التجفيف الدوار ، امسح الشريحة على الفور. تأكد من تحميل الشريحة بعناية في الماسح الضوئي في الاتجاه الصحيح. باستخدام طاقة ليزر منخفضة تبلغ خمسة مللي واط ، قم بمسح الشرائح بشكل متكرر ، مما يزيد الكسب تدريجيا من 25٪ إلى 75٪ أثناء تحسين إعدادات المسح ، ضع في اعتبارك أن الفلوروفورات سوف تبيض مع عمليات المسح المتكررة.

قم بتحليل الصورة المحفوظة لإشارات الربط باستخدام البرنامج المقترن. يمكن تحميل قائمة مصفوفة تحتوي على نمط الإكتشاف. قم بتراكبها على المسح الضوئي للمساعدة في التنقل في موضع علامات الشبكة.

بعد ذلك ، استخدم البرنامج لتحليل شدة البقعة وحفظ النتائج كملف نصي محدد بعلامة تبويب لتصديره إلى جدول بيانات أو حزمة إحصائية أخرى. قم بتحليل البيانات عن طريق حساب متوسط شدة الإشارة مطروحا منها الخلفية. خذ ما معدله أربعة من النقاط الستة المكررة لكل عينة ، مع ترك أعلى إشارة وأدنى إشارة.

بعد ذلك ، قم بإنتاج رسم بياني خطي لمتوسط الإشارة مطروحا منه الخلفية مقابل تركيزات البروتين الثمانية. قم بتنعيم الخط الناتج باستخدام الانحدار غير الخطي. تم استخدام مصفوفة PAA لتقييم خصوصية ارتباط المستقبلات للهيماجلوتينين بفيروس الأنفلونزا A.

تضمنت المصفوفة أدوات تحكم غير سياليلية في نفس الآبار الصغيرة. تم استخدام الليكتين النباتي ذو الخصائص المعروفة للمركبات المطبوعة كعناصر تحكم إيجابية. يرتبط ليكتين ECA بالجالاكتوز الطرفي بيتا 1-4 المرتبط بالأناستيل جلوكوزامين ولم يرتبط بنفس المركب إذا كان الجالاكتوز الطرفي مغطى بحمض السياليك.

لاختبار حمض السياليك المرتبط بألفا 2-6 ، تم استخدام ليكتين SNA. كما هو متوقع ، يرتبط SNA فقط بأحماض السياليك المرتبطة بألفا 2-6 ، ولكن مع وجود اختلافات ملحوظة في التقارب مع تكرارات الصبغة المرتبطة ب PAA مقابل غير PAA المرتبطة ب lacNAc. بعد ذلك ، تم اختبار هيماجلوتينين H5 المشتق من فيروس فيتنام / 1203/04 الذي يتعرف فقط على أحماض السياليك المرتبطة بألفا 2-3.

أظهر المظهر الجانبي الملزم للهيماجلوتينين H5 الخصوصية المتوقعة مع شغف أعلى للهياكل المرتبطة ب PAA. أخيرا ، تم اختبار الهيماجلوتينين H1 من سلالة H1N1 الموسمية البشرية. كما هو متوقع ، يرتبط هذا الهيماجلوتينين فقط بالهياكل المحتوية على حمض السياليك المرتبط بألفا 2-6.

بمجرد إتقانها ، يمكن لهذه التقنية أن تكشف عن الخصائص الملزمة والشغف النسبي لفيروسات الأنفلونزا في اختبار واحد. ستعزز هذه التقنية بشكل كبير كفاءة فحوصات ربط الأنفلونزا بالإضافة إلى تقليل استهلاك المواد البيولوجية الثمينة.