والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

الهدف العام من مصفوفة الغليكان المصغرة هذه هو تحليل نوعية وألفة ارتباط الهيماغلوتينين في فيروس الإنفلونزا A. يمكن لهذا المقايسة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بارتباط مستقبلات فيروس الإنفلونزا A وألفتها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا، ضمن مقايسة واحدة، على معالجة كل من النوعية وألفة الارتباط النسبية، وهو أمر لا يتحقق عادةً في مصفوفات الغليكان التقليدية والمقايسات القائمة على الأطباق.

يبدأ هذا البروتوكول بتحضيرات عينات الغليكان. المحلول الأساسي للغليكانات هو محلول منظم للطباعة (printing buffer) مخزني، والذي يجب معايرته ببطء عند تحضيره ليصل إلى pH 8.5، ثم تُضاف إليه مادة خافضة للتوتر السطحي. باستخدام المحلول المنظم للطباعة المُحضّر، يتم تخفيف الغليكانات المقترنة بـ PAA لتصل إلى 100 micrograms per milliliter.

بعد ذلك، يتم تخفيف الغليكانات أحادية التكافؤ إلى 100 micromolar في محلول الطباعة المنظم أيضاً. وأخيراً، يتم تحضير مخزونات عمل من الأصباغ الوظيفية الأمينية بتركيز one micromolar. الآن، يتم تحميل ten microliters من كل عينة غليكان في بئر من لوحة معايرة دقيقة ذات 384 بئراً.

تكفي هذه الكمية من المحلول لطباعة خمس شرائح. كذلك، انقل 10 µL من صبغة العلامة إلى بئر واحدة من لوحة الطباعة. استعد لطباعة المصفوفات من خلال تحديد موضع دبابيس المصفوفة ورأس الطباعة أولاً وفقاً للمخطط.

في هذه الحالة، يمكن لدبوس واحد طباعة جميع العينات. يتم طباعة مصفوفات الغليكانات في مجموعات مكونة من ستة، وتحيط بها بقعة فارغة من جميع الجوانب. ارتدِ القفازات للتعامل مع الشرائح.

قم بإخراجها من غلافها وانفخ أي شوائب عن أسطحها باستخدام غاز النيتروجين عالي النقاء. بعد ذلك، ضع الشرائح بحيث يكون الجانب المطلي للأعلى على منصة جهاز توزيع المصفوفات (arrayer stage). ثم، قم ببرمجة الجهاز.

في هذه الحالة، يتم برمجة 27 نقطة لكل زيارة للصفيحة المصدر. تُستخدم ثلاث نقاط تمهيدية موضوعة في المنطقة غير المخصصة للمصفوفة على شريحة مغلفة بـ poly-L-lysine لإزالة السائل الزائد من طرف المسبار. أما النقاط الـ 24 الأخرى لكل زيارة مسبار، فتُستخدم لوضع ست نقاط في أربع مصفوفات مكررة.

تتوفر التفاصيل في البروتوكول النصي. الآن، قم بتحميل الأطباق متعددة الآبار في الطابعة وابدأ في طباعة المصفوفات. أثناء الطباعة، تأكد من بقاء الرطوبة بين 55 و 65%. انتبه لمظهر البقع التمهيدية على الشرائح المطلية بـ poly-L-lysine.

بعد الطباعة، افحص كل شريحة بصرياً. تحقق من المحاذاة الصحيحة للبقع داخل حدود التفلون، وهو أمر حيوي، وتحقق من العدد الصحيح للمعالم المطبوعة. وللمساعدة في تجانس التصاق النقاط، ضع الشرائح المطبوعة في غرفة رطوبة 100% بحيث يكون الجانب المطبوع موجهاً للأعلى مباشرة بعد تحضيرها.

استخدم مناشف ورقية مبللة لتبطين وعاء ورف مؤقت. غلف الحجرة بالبلاستيك لاحتجاز الرطوبة. بعد مرور نصف ساعة، قم بإزالة الشرائح.

بعد ذلك، قم بترقيم الشرائح باستخدام قلم تحديد مقاوم للمذيبات واحفظها في صندوق تجفيف طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بتحضير محلول مخزون جديد من المنظم الحاضن (blocking buffer) مع التقليب القوي. اضبط قيمة pH لتصبح 9.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم المركز.

بعد ذلك، تُحضن الشرائح في المحلول المنظم لمدة ساعة. ولإزالة مادة الحجب، تُغسل الشرائح بالماء المقطر مرتين. ثم تُنقل الشرائح إلى حاملات تلوين زجاجية، وتوضع الحاملات في حامل صفائح متأرجح لتدوير الشرائح حتى تجف عند 10 G's لمدة خمس دقائق.

بمجرد جفافها، تُخزن الشرائح عند -20 °C في أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق إذا لزم الأمر. وللتحضير، يتم تجهيز غرفة ترطيب أخرى كما سبق. وللكشف عن الغليكانات المثبتة، يتم تحضير ليكتينات SNA و ECA المبيوتينية بتركيز 10 µg/mL في محلول الفحص المنظم، ويضاف 2 µg/mL من streptavidin 555 إلى كل تخفيف.

للصبغ باستخدام الهيماجلوتينينات، قم بتحضير محلول بتركيز 20 microgram per milliliter من الأجسام المضادة المعقدة مسبقاً في محلول الحجب بنسبة مولية 4:2:1 كما هو موضح في البروتوكول النصي. انقل 20 microliters من المحاليل المحضرة إلى آبار لوحة ذات 384 بئراً. بعد ذلك، قم بتخفيف الليكتينات والهيماجلوتينينات تسلسلياً بنسبة 1:1 في المحاليل المنظمة المناسبة لها.

قم بإجراء ثمانية تخفيفات، مع ملء كل بئر بـ 10 µL من العينة و 10 µL من المنظم. بعد ذلك، قم بتحضين اللوح على الثلج لمدة 30 دقيقة. الآن، أضف 8 µL من كل تخفيف إلى أحد الآبار الدقيقة الـ 48 الموجودة على شريحة مطبوعة.

بعد ذلك، يتم تحضين الشريحة المجهزة في غرفة الترطيب لمدة 90 دقيقة. وبعد مرور 90 دقيقة، تُغسل الشريحة مع الإمساك بها من الحافة؛ حيث تُغمر في PBS-T أربع مرات، ثم تُغمر في PBS أربع مرات، وأخيراً تُغمر في الماء منزوع الأيونات أربع مرات. الآن، يتم تجفيف الشريحة بالتدوير كما في السابق.

بعد التجفيف بالدوران، قم بمسح الشريحة ضوئياً على الفور. تأكد من وضع الشريحة بعناية في الماسح الضوئي بالاتجاه الصحيح. باستخدام قوة ليزر منخفضة تبلغ 5 mW، قم بمسح الشرائح بشكل تكراري، مع زيادة الكسب تدريجياً من 25% إلى 75%. وأثناء تحسين إعدادات المسح، ضع في اعتبارك أن الفلوروفورات سوف تبهت مع تكرار عمليات المسح.

قم بتحليل الصورة المحفوظة للكشف عن إشارات الارتباط باستخدام البرنامج المرتبط. يمكن تحميل قائمة مصفوفة تحتوي على نمط التنقيط، وقم بتراكبها فوق المسح الضوئي للمساعدة في تحديد مواقع علامات الشبكة.

بعد ذلك، استخدم البرنامج لتحليل كثافة البقع وحفظ النتائج في ملف نصي مفصول بعلامات جدولة لتصديره إلى جدول بيانات أو أي حزمة إحصائية أخرى. قم بتحليل البيانات عن طريق حساب متوسط كثافة الإشارة مطروحاً منها الخلفية. احسب متوسط أربعة من البقع المكررة الست لكل عينة، مع استبعاد أعلى إشارة وأقل إشارة.

بعد ذلك، قم بإنشاء رسم بياني خطي يوضح متوسط متوسط الإشارة مطروحاً منه الخلفية مقابل تركيزات البروتين الثمانية. قم بتنعيم الخط الناتج باستخدام الانحدار غير الخطي. استُخدمت مصفوفة PAA لتقييم خصوصية ارتباط مستقبلات هماغلوتينين فيروس الإنفلونزا أ.

تضمنت المصفوفة ضوابط غير مُسيللة في نفس الآبار الدقيقة. واستُخدمت ليكتينات نباتية ذات خصوصيات معروفة للمركبات المطبوعة كضوابط إيجابية. ارتبط ليكتين ECA بالجالاكتوز الطرفي المرتبط بـ beta 1-4 بـ anacetylglucosamine، ولم يرتبط بالمركب نفسه إذا كان الجالاكتوز الطرفي مغطى بحمض السياليك.

لاختبار حمض السياليك المرتبط برابطة ألفا 2-6، استُخدم ليكتين SNA. وكما كان متوقعاً، ارتبط SNA فقط بأحماض السياليك المرتبطة برابطة ألفا 2-6، ولكن مع وجود اختلافات ملحوظة في الألفة تجاه تكرارات lacNAc المصبوغة المرتبطة بـ PAA مقابل تلك غير المرتبطة بـ PAA. بعد ذلك، تم اختبار H5 hemagglutinin مشتق من فيروس Vietnam/1203/04 والذي يتعرف فقط على أحماض السياليك المرتبطة برابطة ألفا 2-3.

أظهر ملف الارتباط لبروتين الهيماجلوتينين H5 النوعية المتوقعة مع ألفة أعلى للبنى المرتبطة بـ PAA. وأخيراً، تم اختبار الهيماجلوتينين H1 من سلالة H1N1 الموسمية البشرية. وكما كان متوقعاً، ارتبط هذا الهيماجلوتينين فقط بالبنى التي تحتوي على حمض السياليك المرتبط بـ alpha 2-6.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكنها الكشف عن خصوصيات الارتباط والألفة النسبية لفيروسات الإنفلونزا ضمن مقايسة واحدة. ستعمل هذه التقنية على تعزيز كفاءة مقايسات ارتباط الإنفلونزا بشكل كبير، فضلاً عن تقليل استهلاك المواد البيولوجية الثمينة.