مضان الوقت الفاصل بين التصوير من كامل

الهدف العام من بروتوكول المجهر الفلوري بنظام التصوير الزمني هو توفير طريقة لدراسة العمليات الخلوية البيولوجية التي تدعم التطور والتمايز الخلوي في البكتيريا الخيطية المتبوغة، Streptomyces venezuelae. توفر الطريقة الموصوفة منصة ممتازة لدراسة العمليات البيولوجية الخلوية المركزية في دورة حياة Streptomyces، بما في ذلك التموضع الديناميكي للبروتين، والنمو المستقطب، وتكون الحواجز أثناء التبوغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن Streptomyces venezuelae تتبوغ في الوسط السائل، مما يتيح لنا تنمية الخلايا في جهاز ميكروفلويديك ومراقبة دورة الحياة الكاملة مجهرياً.

توضح هذه الطريقة الإمكانات الهائلة لبكتيريا Streptomyces venezuelae كنظام تطويري جديد لهذا الجنس، لأنها تسمح بالتصوير الحي للخلايا أثناء تمايز الميسليوم متعدد المراكز إلى سلاسل من الأبواغ. للبدء، قم بتلقيح 30 milliliters من وسط نمو مدعم بـ 10 microliters من أبواغ سلالة S.venezuela المراد تصويرها. ولضمان نمو وتَبَوُّغ الخلايا بشكل متسق، استخدم دورقاً بحواجز (baffled flask) أو دورقاً يحتوي على نابض للسماح بتهوية كافية.

قم بزراعة الخلايا لمدة تتراوح بين 35 إلى 40 ساعة عند 30 درجة مئوية وبسرعة 250 RPM. وعندما تصبح جاهزة، يجب أن تكون قادراً على رؤية شظايا الغزل الفطري والأبواغ عبر مجهر تباين الطور باستخدام التثبيت السائل. قم بطرد ملليلتر واحد من المزرعة مركزياً في جهاز طرد مركزي مكتبي عند 400 ×g لمدة دقيقة واحدة لترسيب الغزل الفطري وشظايا الخلايا الأكبر حجماً.

بعد ذلك، انقل حوالي 300 microliters من supernatant الذي يحتوي على معلق من الأبواغ إلى أنبوب جديد سعة 1.5 millimeter وضع الأنبوب على الثلج. احتفظ بما تبقى من وسط المزارع لاستخدامه في خطوة لاحقة. بعد ذلك، خفف الأبواغ بنسبة 1 إلى 20 في وسط نمو مكمل، واحفظ الأبواغ المخففة على الثلج حتى وقت الحاجة إليها.

صُبّ وسط المزرعة المتبقي في كأٍس سعة 50-milliliter، ثم اسحب 10-milliliters باستخدام حقنة، واستخدم مرشح حقنة معقم بمسامية 22-micrometer لتعقيم وسط المزرعة المتبقي عن طريق الترشيح؛ وذلك للحصول على وسط نمو مكمل مستنفدٍ خالٍ من الأبواغ وقطع الغزل الفطري. يُحفظ وسط النمو المكمل المستنفد والمُرشح لبضعة أيام عند درجة حرارة four-degrees-celsius في حال الرغبة في إجراء تجارب إضافية باستخدام ظروف نمو مماثلة.

يمكن استخدام كل لوحة مائعية دقيقة في ما يصل إلى أربع تجارب مستقلة. ولتجنب تلوث غرف التدفق غير المستخدمة، تأكد من استخدام محاليل وظروف عمل معقمة عند إعداد التجربة. ابدأ بإزالة محلول الشحن من اللوحة المائعية الدقيقة.

بعد ذلك، اشطف الآبار بوسط نمو مكمل معقم. وبمجرد الانتهاء من الشطف، أضف 300 µL من وسط النمو المكمل إلى مدخل البئر الأول، و 300 µL من وسط النمو المكمل المستنفد إلى الآبار من الثاني إلى السادس. بعد ذلك، حمّل 40 µL من الأبواغ المخففة في البئر الثامن من الممر A، ثم أحكم إغلاق المجمع باللوحة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتشغيل برنامج التحكم في الجهاز الموائع الدقيقة واختر نوع اللوحة المناسب. قم بإعداد برنامج تدفق لتدفق الوسط من آبار المدخل من واحد إلى خمسة بضغط 6 psi لمدة دقيقتين لكل بئر لتهيئة قناة التدفق وغرفة الزراعة. بعد ذلك، اجعل البرنامج يتدفق وسط نمو مكمل بضغط 6 psi في بئر المدخل واحد لمدة ست ساعات.

سيسمح ذلك بحدوث الإنبات والنمو الخضري. اضبط البرنامج ليتحول بعد ست ساعات إلى وسط النمو المكمل المستنفد، وتدفقه في الآبار من الثاني إلى الخامس بضغط 6 psi لما تبقى من التجربة. قم بتسخين الغرفة البيئية مسبقاً إلى 30 درجة Celsius.

بعد ذلك، قم بتشغيل المجهر وبرنامج التحكم في المجهر. ضع عدسة شيئية غمر زيتية ذات فتحة عددية عالية في مكانها، وتأكد من وضع المرشحات والمرايا المخططية المناسبة لالتقاط صور التباين التداخلي التفاضلي، بالإضافة إلى صور اندماجات البروتينات الفلورية الصفراء والحمراء. ضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الشيئية وأيضاً في الجزء السفلي من نافذة التصوير في الشريحة المائعية الدقيقة.

قم بتثبيت الجهاز الموائع الدقيقة المختوم بعناية على منصة المجهر المقلوب وأحكم تثبيته في مكانه. استخدم علامات تحديد الموضع المدمجة لضبط نافذة التصوير الخاصة بغرفة استزراع الموائع الدقيقة في بؤرة التركيز. ركز على الجزء الأقصى يساراً من غرفة التدفق الأولى المسمى A، ثم حرك المنصة للوصول إلى المصيدة ذات الحجم خمسة، والتي تتوافق مع ارتفاع مصيدة يبلغ 7 micrometers.

في برنامج الموائع الدقيقة، اضبط النظام لتحميل الخلايا من بئر المدخل الثامن بضغط 4 psi لمدة 15 ثانية. بعد تشغيل العملية، تحقق من كثافة الخلايا في غرفة الزرع عن طريق تحريك المنصة عبر نافذة التصوير. إذا لم يتم احتجاز أي أبواغ، كرر خطوة تحميل الخلايا، أو بدلاً من ذلك، قم بزيادة ضغط و/أو وقت التحميل حتى يتم الوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة والتي تتراوح من بوغ واحد إلى 10 أبواغ لكل نافذة تصوير.

احرص على تجنب التحميل الزائد لحجرة الزرع. بعد ذلك، ابدأ برنامج التدفق الذي تم إعداده مسبقاً في برنامج التحكم، واترك اللوحة الموائع دقيقة لتصل إلى حالة التوازن الحراري لمدة ساعة واحدة على منصة المجهر قبل البدء في عملية الحصول على الصور. في برنامج التحكم بالمجهر، قم بإعداد عملية استحواذ متعددة الأبعاد لالتقاط صور متعددة في مواقع منصة متعددة بمرور الوقت، وذلك من خلال تحديد دليل لحفظ ملفات الصور تلقائياً أولاً.

بعد ذلك، انتقل إلى إعدادات الإضاءة وأدخل إعدادات الإضاءة المثلى المحددة مسبقاً لكل بنية محددة. ثم قم بإعداد سلسلة زمنية لالتقاط الصور كل 40 دقيقة لمدة 24 ساعة. ومن أجل تحديد مواضع المنصة وضبط التركيز التلقائي، قم بمسح غرفة المزرعة وتخزين مواضع المنصة لكل موضع تصوير مطلوب.

تأكد من تباعد مواضع المنصة أحادية المرحلة بما يكفي لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية. وبمجرد التحقق من إحداثيات Z لمواضع المنصة المختارة، قم بتنشيط التركيز البؤري التلقائي للأجهزة. ثم ابدأ تجربة التصوير الزمني في برنامج التحكم في المجهر.

أوقف عملية الحصول على الصور بعد مرور 24 إلى 30 ساعة، أو عندما تتمايز الخيوط الفطرية في المنطقة المستهدفة إلى أبواغ. بعد ذلك، أوقف برنامج التدفق في البرنامج التشغيلي وقم بتفكيك الجهاز الموائع الدقيقة. جهز لوحة الموائع الدقيقة المستخدمة للتخزين قصير المدى عن طريق إزالة أي وسط متبقٍ من آبار المدخل، وبئر النفايات، وبئر تحميل الخلايا.

بعد ذلك، املأ الآبار المستخدمة في المسار A وآبار المسارات غير المستخدمة بمحلول PBS المعقم. وأخيراً، قم بتغطية الطبق بغشاء Parafilm لمنعه من الجفاف. ثم خزن الطبق في درجة حرارة 4 °C.

يؤدي التصوير الناجح للخلايا الحية لدورة حياة *S.venezuela* بأكملها إلى الحصول على سلسلة زمنية مستمرة، تشمل المراحل التنموية الرئيسية المتمثلة في الإنبات، والنمو الخضري، والتبوغ. وخلال مرحلتي الإنبات أو النمو الخضري، يتراكم DivIVA-mCherry حصرياً عند القمم الهيفية النامية أو يحدد نقاط تفرع الهيفات حديثة التكوين. وفي المقابل، يشكل FtsZ-YPet هياكل حلقية مفردة على فترات غير منتظمة في الغزل الفطري النامي.

توفر هذه البنى الدعامة لتخليق جدران عرضية خضرية غير إنشائية تؤدي إلى تكوين مقصورات خيطية مترابطة. وفي الخيوط المتبوغة، يتغير نمط تموضع FtsZ-YPet بشكل كبير؛ حيث تتدحرج أولاً خيوط FtsZ-YPet الحلزونية على طول الخيط، ثم وفي حدث مفاجئ وشبه متزامن، تندمج هذه الحلزونات لتشكل سلماً من حلقات FtsZ-YPet متباعدة بانتظام.

وفي النهاية، تصبح حواجز التبوغ مرئية في صور تباين التداخل التفاضلي، وفي نهاية المطاف، يتم إطلاق الأبواغ الجديدة. توفر هذه التقنية بروتوكولاً قوياً لإجراء تصوير حي للخلايا لدورة حياة Streptomyces الكاملة. كما أن نظام الموائع الدقيقة سهل الاستخدام.

يوفر هذا الإعداد التجريبي مرونة تجريبية ويسمح بالمراقبة طويلة المدى، كما يمثل نقطة بداية ممتازة لاستقصاء أحداث نمائية محددة استجابةً لتغير الظروف الزرعية، أو استخدام الأصباغ الفلورية لمراقبة تخليق الببتيدوجليكان أو لتصوير تنظيم الكروموسومات.