مضان الوقت الفاصل بين التصوير من كامل S. venezuelae دورة الحياة عن طريق جهاز ميكروفلويديك

الهدف العام من بروتوكول الفحص المجهري بفاصل زمني فلورسنت هو توفير طريقة لدراسة عمليات الخلايا البيولوجية التي تدعم التطور والتمايز الخلوي في البكتيريا الخيطية الأبواغية ، Streptomyces venezuelae. توفر طريقة الوصف منصة ممتازة لدراسة العمليات البيولوجية للخلية التي تعتبر أساسية لدورة حياة Streptomyces ، بما في ذلك توطين البروتين الديناميكي والنمو المستقطب وفصل الأبواغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن Streptomyces venezuelae تتبوغ في سائل ، مما يسمح لنا بزراعة الخلايا في جهاز ميكروفلويديك ومراقبة دورة الحياة الكاملة مجهريا.

توضح هذه الطريقة الإمكانات الهائلة ل Streptomyces venezuelae كنظام تنموي جديد للجنس ، لأنها تسمح بتصوير الخلايا الحية لتمايز الفطريات متعددة المراكز إلى سلاسل من الجراثيم. للبدء ، قم بتلقيح 30 مل من وسط النمو المكمل ب 10 ميكرولترات من الجراثيم من سلالة S.Venezuela المراد تصويرها. من أجل نمو الخلايا بشكل متسق وتبواغها ، استخدم قارورة محيرة أو قارورة تحتوي على زنبرك للسماح بالتهوية الكافية.

استزراع الخلايا لمدة 35 إلى 40 ساعة عند 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. عندما تكون جاهزا ، يجب أن تكون قادرا على رؤية شظايا الجراثيم الفطرية عبر الفحص المجهري لتباين الطور المثبت على السائل. جهاز طرد مركزي واحد ملليلتر من الثقافة في جهاز طرد مركزي منضدية عند 400 مرات [غ] لمدة دقيقة واحدة لتكبيل الفطريات وال [كبر] خلية شظايا.

ثم انقل ما يقرب من 300 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على تعليق من الجراثيم ، إلى أنبوب جديد 1.5 ملم ووضع الأنبوب على الجليد. احتفظ بوسط الاستزراع المتبقي لاستخدامه في خطوة لاحقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجراثيم من واحد إلى 20 في وسط النمو المكمل ، واحتفظ بالجراثيم المخففة على الجليد حتى الحاجة إليها.

صب وسط الاستزراع المتبقي في دورق سعة 50 مليلتر ثم اسحب 10 ملليلتر بحقنة واستخدم مرشح حقنة معقم 22 ميكرومتر لتصفية تعقيم وسط الثقافة المتبقي. للحصول على وسط نمو مكمل مستنفد خال من الجراثيم والشظايا الفطرية. احتفظ بوسط النمو المكمل المصفى لبضعة أيام عند أربع درجات مئوية إذا تم إجراء تجارب إضافية ، باستخدام ظروف نمو مماثلة.

يمكن استخدام كل صفيحة موائع دقيقة لما يصل إلى أربع تجارب مستقلة. لتجنب تلويث غرف التدفق غير المستخدمة ، تأكد من استخدام محاليل معقمة وظروف عمل عند إعداد التجربة. ابدأ بإزالة محلول الشحن من لوحة الموائع الدقيقة.

ثم شطف الآبار مع معقمة المكمل الوسط الكاملة. بمجرد شطفها ، أضف 300 ميكرولتر من وسط النمو المكمل إلى مدخل البئر الأول ، و 300 ميكرولتر من وسط النمو المكمل المستهلك إلى الآبار من اثنين إلى ستة. بعد ذلك ، قم بتحميل 40 ميكرولترا من الجراثيم المخففة إلى ثمانية من الممر A وأغلق المشعب على اللوحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتشغيل برنامج التحكم في الموائع الدقيقة وحدد نوع اللوحة المناسب. قم بإعداد برنامج تدفق لتدفق الوسط من آبار المدخل من واحد إلى خمسة عند ستة رطل لكل بوصة مربعة لمدة دقيقتين لكل بئر من أجل تجهيز قناة التدفق وغرفة الاستزراع. ثم اجعلها تتدفق وسط النمو المكمل عند ستة رطل لكل بوصة مربعة في بئر مدخل واحد لمدة ست ساعات.

سيسمح ذلك بحدوث الإنبات والنمو الخضري. اطلب من البرنامج التبديل بعد ست ساعات إلى وسط النمو المكمل المستهلك وقم بتدفقه إلى الآبار من اثنين إلى خمسة بمعدل ستة رطل لكل بوصة مربعة لبقية التجربة. قم بتسخين الغرفة البيئية مسبقا إلى 30 درجة مئوية.

ثم قم بتشغيل المجهر وبرنامج التحكم في المجهر. ضع هدفا عالي الغمر بالزيت بفتحة عددية عالية في مكانه وتأكد من أن المرشحات المناسبة والمرايا التخطيطية التي تم تعيينها للحصول على صور تباين التداخل التفاضلي ، جنبا إلى جنب مع صور اندماج البروتين الفلوري الأصفر والبروتين الفلوري الأحمر في مكانها الصحيح. ضع قطرة من زيت الغاطس في الهدف وفي أسفل نافذة التصوير على لوحة الموائع الدقيقة أيضا.

قم بتركيب جهاز الموائع الدقيقة المغلق بعناية على منصة المجهر المقلوب وثبته في مكانه. استخدم علامات الموضع المضمنة لتركيز نافذة التصوير لغرفة زراعة الموائع الدقيقة. ركز على الجزء الموجود في أقصى اليسار من غرفة التدفق الأولى المسماة A، ثم حرك المرحلة إلى حجم الاقتباس الخامس، المقابل لارتفاع المصيدة البالغ 7 ميكرومتر.

في برنامج الموائع الدقيقة ، اضبط النظام على تحميل الخلايا من بئر المدخل ثمانية عند أربعة رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 ثانية. بعد تشغيل العملية ، تحقق من كثافة الخلايا في غرفة الثقافة عن طريق تحريك المرحلة عبر نافذة التصوير. إذا لم يتم احتجاز الجراثيم ، كرر خطوة تحميل الخلية أو بدلا من ذلك ، قم بزيادة ضغط التحميل و / أو الوقت حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة من واحد إلى 10 جراثيم لكل نافذة تصوير.

احرص على تجنب التحميل الزائد على غرفة الثقافة. بعد ذلك ، ابدأ برنامج التدفق المعد مسبقا في برنامج التحكم واسمح للوحة الموائع الدقيقة بالتوازن الحراري لمدة ساعة واحدة في مرحلة المجهر قبل البدء في الحصول على الصورة. في برنامج التحكم في المجهر ، قم بإعداد عملية اكتساب متعددة الأبعاد لالتقاط صور متعددة في مواضع متعددة المراحل بمرور الوقت عن طريق تحديد دليل للحفظ التلقائي لملفات الصور أولا.

بعد ذلك ، انتقل إلى إعدادات الإضاءة وأدخل إعدادات الإضاءة المثلى المحددة مسبقا لكل بنية محددة. ثم قم بإعداد سلسلة زمنية للحصول على الصور كل 40 دقيقة لمدة 24 ساعة. من أجل تحديد مواضع المرحلة وضبط التركيز البؤري التلقائي ، قم بمسح غرفة الثقافة وتخزين مواضع المرحلة لكل موضع تصوير مثير للاهتمام.

تأكد من أن مواضع المرحلة الواحدة متباعدة بما يكفي لتقليل تبييض الصور وسمية الصورة. بمجرد التحقق من إحداثيات Z لمواضع المرحلة المحددة ، قم بتنشيط التركيز البؤري التلقائي للجهاز. ثم ابدأ تجربة الفاصل الزمني في برنامج التحكم في المجهر.

أوقف الحصول على الصورة بعد 24 إلى 30 ساعة ، أو عندما تتمايز الخيوط في المنطقة المعنية إلى جراثيم. ثم أوقف برنامج التدفق في البرنامج وقم بتفكيك جهاز الموائع الدقيقة. قم بإعداد لوحة الموائع الدقيقة المستخدمة للتخزين قصير الأجل عن طريق إزالة أي وسيط متبقي من آبار المدخل وبئر النفايات وبئر تحميل الخلية.

ثم املأ الآبار المستخدمة في الممر A وآبار الممرات غير المستخدمة ب PBS المعقمة. أخيرا ، أغلق اللوحة بغشاء الكمثرى لمنعها من الجفاف. وقم بتخزين الطبق عند أربع درجات مئوية.

عن التصوير الناجح للخلايا الحية لدورة حياة S.Venezuela بأكملها سلسلة زمنية مستمرة ، بما في ذلك مراحل النمو الرئيسية للإنبات والنمو الخضري والتبواغ. أثناء الإنبات أو النمو الخضري ، يتراكم DivIVA-mCherry حصريا عند الأطراف المغناطيسية المتنامية أو يشير إلى نقاط تفرع خيوطية حديثة التكوين. في المقابل ، تشكل FtsZ-YPet هياكل مفردة تشبه الحلقة على فترات غير منتظمة في الفطريات المتنامية.

توفر هذه الهياكل سقالة لتخليق الجدران المتقاطعة الخضرية غير البناءة مما يؤدي إلى تكوين مقصورات خيوطية مترابطة. في خيوط الأبواغ ، يتغير نمط توطين FtsZ-YPet بشكل كبير. أولا ، تتعثر خيوط FtsZ-YPet الحلزونية على طول الحافة ، ثم في حدث مفاجئ ومتزامن تقريبا ، تتحد هذه الحلزونات في سلم من حلقات FtsZ-YPet المتباعدة بانتظام.

أخيرا ، يصبح الحاجز الأبواغي واضحا في صور تباين التداخل التفاضلي وفي النهاية يتم إطلاق الجراثيم الجديدة. توفر هذه التقنية بروتوكولا قويا لإجراء تصوير الخلايا الحية لدورة حياة Streptomyces الكاملة. نظام الموائع الدقيقة سهل الاستخدام.

إنه يوفر مرونة تجريبية ويسمح بمراقبة طويلة الأمد لهذا الإعداد التجريبي يوفر أيضا نقطة انطلاق رائعة للتحقيق في أحداث تنموية محددة استجابة للظروف الثقافية المتغيرة أو استخدام الأصباغ الفلورية لمراقبة تخليق الببتيدوغليكان أو لتصور تنظيم الكروموسوم.